Injektion af Hydrogel Biomateriale Stilladser til hjernen efter slagtilfælde

Summary

Slagtilfælde er et globalt problem med minimale behandlingsmuligheder og ingen nuværende klinisk behandling for regenerering af det tabte hjernevæv. Her beskriver vi metoder til at skabe præcise fotothrombotic slagtilfælde i den motoriske cortex af gnavere og efterfølgende injektion af hydrogel biomaterialer til at studere deres virkninger på væv regenerering efter slagtilfælde.

Abstract

Stroke er den hyppigste årsag til handicap og den femtestørste dødsårsag i USA. Ca. 87% af alle slagtilfælde er iskæmiske slagtilfælde og defineres som den pludselige blokering af et fartøj, der leverer blod til hjernen. Få minutter efter blokeringen begynder cellerne at dø og resultere i uoprettelige vævsskader. Nuværende terapeutiske behandlinger fokuserer på fjernelse af blodpropper eller lysis for at give mulighed for reperfusion og forhindre mere alvorlige hjerneskader. Selv om forbigående hjernen plasticitet kan redde nogle af de beskadigede væv over tid, betydelige fraktioner af patienter er tilbage med neurologiske underskud, der aldrig vil løse. Der er mangel på terapeutiske muligheder for at behandle neurologiske underskud forårsaget af slagtilfælde, understreger behovet for at udvikle nye strategier til behandling af denne voksende patientpopulation. Injicerbare biomaterialer er i øjeblikket ved at blive designet til at forbedre hjernens plasticitet og forbedre endogene reparation gennem levering af aktive stoffer eller stamceller. En metode til at teste disse tilgange er at udnytte en gnaver slagtilfælde model, injicere biomaterialet i slagtilfælde kerne, og vurdere reparation. Kendskab til den præcise placering af slagtilfælde kerne er bydende nødvendigt for den nøjagtige behandling efter slagtilfælde, derfor, et slagtilfælde model, der resulterer i en forudsigelig slagtilfælde placering er at foretrække at undgå behovet for billeddannelse før injektion. Følgende protokol vil dække, hvordan man fremkalder et fotothrombotisk slagtilfælde, hvordan man injicerer en hydrogel på en kontrolleret og præcis måde, og hvordan man ekstraherer og kryosection hjernen samtidig med at biomaterialet forbliver intakt. Derudover vil vi fremhæve, hvordan de samme hydrogelmaterialer kan bruges til samlevering af stamceller. Denne protokol kan generaliseres til brug af andre injicerbare biomaterialer i slagtilfældekernen.

Introduction

Stroke er den hyppigste årsag til handicap og den femte hyppigste dødsårsag i USA¹. Ca. 87% af alle slagtilfælde er iskæmiske, mens størstedelen af de resterende 13% er hæmoragiske². En iskæmisk slagtilfælde er defineret som blokering af blodgennemstrømningen i en arterie til det omgivende væv. Denne okklusion resulterer i iltmangel og efterfølgende nekrose, der ofte fører til permanent handicap hos overlevende patienter. Mens der har været et fald i dødeligheden af slagtilfælde³, forventes dens udbredelse at stige til 3,4 millioner mennesker i 2030⁴. Denne stigning i handicappede overlevende og deraf følgende økonomiske byrde har ført til et skub til slagtilfælde forskning, der fokuserer på mekanismer for neural reparation. Efter slagtilfælde er der en inflammatorisk periode, der fører til dannelsen af et ar, der forhindrer den nekrotiske region i at udvide sig. Regionen omkring den nekrotiske kerne kaldes “peri-infarct”, og der er et stærkt bevis for, at plasticiteten i denne region, som omfatter øget angiogenese, neurogenese og axonal spiring, er direkte forbundet med den observerede genopretning i dyremodeller og mennesker⁵. Da der ikke er nogen in vitro-modeller, der korrekt kan replikere de komplekse interaktioner efter slagtilfælde, er dyremodeller afgørende for slagtilfældeforskning.

Der er flere in vivo modeller, der kan bruges til at producere iskæmisk slagtilfælde. En af de mest almindelige modeller, der anvendes i mus er midten cerebral arterie okklusion, eller MCAo, gennem distale eller proksimale (via intra-arteriel glødetråd) okklusion. Den proksimale model, også kendt som glødetråd MCAo (fMCAo), typisk resulterer i store iskæmiske slagtilfælde, der omfatter overalt fra 5% til 50% af hjernehalvdelen, afhængig af antallet af faktorer⁶. I disse modeller, en sutur eller glødetråd er avanceret fra den indre halspulsåren i bunden af den midterste cerebral arterie (MCA) og holdes på plads i en bestemt periode. Denne metode til okklusion, som kan gøres midlertidig eller permanent, producerer en infarkt, der er centreret i striatum og måske eller måske ikke indebærer overlying cortex⁶. Den resulterende slagtilfælde størrelse er meget variabel, og billeddannelse teknikker, såsom laser doppler, er forpligtet til at bekræfte effektiviteten af proceduren i hver mus. Intra-arteriel eller intra-luminal glødetråd okklusion, der varer mere end 30 minutter producerer slagtilfælde i den større ende af størrelsesområdet. Nogle efterforskere har fokuseret på kortere glødetråd okklusion gange, som kræver betydelige eksperimentelle fokus og lab validering⁷. Filament MCAo modeller i mus følger lignende stadier af celledød, iskæmisk progression, og dannelsen af en peri-infarct region som set i human slagtilfælde tilfælde; men de større slagtilfælde ligner mere sygdomstilstanden af ondartede cerebrale infarkter, som er mindre almindelige, mindre behandlelige menneskelige slagtilfælde⁶. I mellemtiden, distale MCA okklusion kræver en mere involveret kirurgi og craniectomy. I denne model, den distale del af MCA, der løber langs overfladen af hjernen er direkte okkluderet med en sutur slips eller cauterization. I nogle variationer af teknikken er halspulsårerne ensidigt eller forbigående bilateralt okkluderet. En fordel ved den distale MCAo er, at det producerer en kortikale-baseret slagtilfælde, der er mindre variabel i størrelse end glødetråd model. Men den distale model producerer dårligere adfærdsmæssige output på grund af transection af den eksterne halspulsåren (ECA), som også er et problem med fMCAo⁶.

En alternativ slagtilfælde model, der er kendt for at være mindre invasiv er photothrombotic (PT) model. PT-modellen resulterer i en veldefineret placering af iskæmi og er forbundet med en høj overlevelsesrate⁸. Teknikken er afhængig af et lysfølsomt farvestof injiceres intraperitoneally, der giver mulighed for intravaskulær fotooxidation blot ved at bestråle det ønskede væv med en lys eller laser⁹. Ved excitation dannes iltradikaler, der forårsager endotelskader, som aktiverer blodpladeaggregation og blodpropdannelse i det bestrålede område^8,9. Den stramme kontrol over slagtilfælde størrelse og placering, samt høj reproducerbarhed af PT-modellen, gør den ideel til at studere biomaterialer. Mens præcision er muliggjort ved hjælp af en laser og stereotaxiske koordinater, der er nogle ulemper, der kan gøre denne model mindre ideel til få undersøgelser. I modsætning til fMCAo-modellen kan PT-stregmodellen ikke reperfused. Derfor ville materialer til undersøgelse af neuroprotektive midler, der er specifikke for skader efter reperfusion eller mekanismerne efter reperfusion, ikke være nyttige her⁸. Derudover ses relativt lille iskæmisk penumbra på grund af PT-modellens mikrovaskulære fornærmelse. I stedet opstår lokale vasogene ødem, hvilket er ukarakteristisk for human slagtilfælde, hvilket gør denne model uønsket for prækliniske lægemiddelundersøgelser med fokus på det peri-infarct område^6,8.

Det overordnede mål med biomateriale strategier i slagtilfælde er at enten levere bioaktive midler eller til at fungere som en surrogat ekstracellulær matrix for hjernevæv vækst. En strategi, som vi vil udforske ved hjælp af vores metoder, er at levere hydrogel direkte ind i slagtilfældekernen i modsætning til peri-infarktvævet, hvor mange nuværende celleterapier leveres¹⁰. Begrundelsen for denne tilgang er, at levering i det nekrotiske væv, der findes i kernen, vil undgå at forstyrre det omgivende sunde eller genoprettende væv. Vi antager, at diffusion af alle aktive stoffer, der indgår i biomaterialet, vil være i stand til at nå peri-infarct fra kernen, især da vi finder ud af, at levering af hydrogel biomaterialer reducerer tykkelsen af glial ar¹¹. Dette er vigtigt, da peri-infarct regionen har vist sig at udvise neuroplasticitet efter slagtilfælde, hvilket gør det til et attraktivt mål. Desuden kan levering af en surrogatmatrix til stregkernen indlæses med angiogen¹² eller neurogene¹³ faktorer til at guide dannelsen af nyt væv samt celler til levering¹⁴. Celle levering er stærkt forbedret ved hjælp af en matrix, fordi det beskytter celler fra de barske injektion kræfter og lokale miljø til stede under fødslen, samt tilskynder differentiering og indpodning¹⁵.

Disse injicerbare terapeutiske biomaterialer har klinisk relevans i slagtilfælde applikationer, da der i øjeblikket ikke er nogen medicinske behandlinger, der stimulerer neuronal genopretning efter slagtilfælde. De underliggende neurale kredsløb involveret i nyttiggørelse ligger i hjernevæv, der støder op til^{slagtilfældekernen 16}, mens selve slagtilfældekernen er blottet for levedygtigt neuralt væv. Vi forventer, at levere et biomateriale i nekrotiske slagtilfælde kerne har potentiale til at stimulere det tilstødende væv mod regenerative processer gennem en række mekanismer tidligere nævnt, herunder depot frigivelse af vækstfaktorer^13,stimulering af væv in-vækst og fremme af inddrive hjernevæv udvikling^11,12, ændring af immunrespons¹⁷, og levering af stamcelle-afledte terapeutiske^{14, 18}. For effektivt at undersøge muligheden for disse anvendelser er der imidlertid behov for en konsekvent og reproducerbar metode til fremstilling af slagtilfælde og injektion af biomaterialer. PT-stregmodellen bruger teknikker, der giver præcis kontrol over slagtilfældets retning og placering. En laser, der er fastgjort til den stereotaxiske enhed, styrer retninger, og pumper, der er fastgjort til de stereotaxiske enheder, styrer materialets injektionshastighed uden behov for yderligere former for billeddannelse. Derfor har vi valgt at beskrive metoderne til at udføre et PT-slagtilfælde i musenes motoriske cortexer og til injektion af biomaterialer i slagkernen. Her bruger vi mikroporøse annealed partikel (MAP) hydrogels som biomateriale til injektion uden tilsatte celler eller vækstfaktorer. Derudover forklarer vi, hvordan man med succes kan hente hjernen med intakt biomateriale, og vi diskuterer immunkemi assays bruges til at analysere slagtilfælde resultatet med og uden injektion af biomaterialer.

Protocol

Forsøgene blev udført i overensstemmelse med IUCAC på Duke University og University of California Los Angeles. Der blev anvendt 8 til 12 uger gamle C57Bl/6J-mus fra hannen i denne undersøgelse. Dyrene blev opstaldet under kontrolleret temperatur (22 ± 2 °C), med en 12 timers lys-mørk cyklus periode og adgang til pelleted mad og vand ad libitum. Analgesi- og sedationsprotokoller beskrives som godkendt af IUCAC, men kan afvige fra protokoller, der anvendes i andre laboratorier. Dyr kan af…

Representative Results

Formålet med denne metode var at demonstrere, hvordan man injicerer biomaterialer i hjernen efter slagtilfælde. En fotothrombotic model med rose bengal og en 520 nm laser blev brugt til kontrolleret orientering af slagtilfælde læsion i både størrelse og placering. Fem dage efter slagtilfælde infarkt kunne visualiseres under operationen (Figur 1B) og ved TTC og billeddannelse IHC farvede dias (Figur 2). En stigning i laserdiameteren med en 2x linse fører …

Discussion

Her demonstrerer vi en let reproducerbar, minimalt invasiv, permanent slagtilfælde model og beskrive, hvordan man injicerer et biomateriale i infarkt fem dage efter slagtilfælde. Brugen af fotothrombotic farvestof Rose Bengal og en 520 nm kolieret laser tilsluttet den stereotaxiske enhed giver os mulighed for at placere slagtilfælde på motoren cortex af musen med forbedret præcision. Fem dage efter slagtilfælde er infarktens placering synlig for øjet i midten af bestråling, 2,0 mm medio-lateral til bregmaen. Hydr…

Materials

10% Normal Goat Serum	VWR	100504-028	For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium	Medline	MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle	Fishcer Scientific	14824663	Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette	Gilson	M-25
2x Beam Expander, 400-650nm	Thorlabs	GBE02-A	Laser beam expander
Adjustable Stage Platform	Kopf Instruments	901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit	Abcam	ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat	abcam	ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12"	Medsupply	367294	For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil	Thorlabs	BKF12	To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2"	Sklar surgical instruments	64-2035
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664	8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter	Fine Science Tools	19007-05	For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate	VWR	EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers	Thorlabs	CLD1010LP
Cotton Swabs	VWR	89031-288
CP 25 pipette tips	Gilson	F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488)	abcam	ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647)	abcam	ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555)	abcam	ab150154
EMS DPX Mountant	Elecron Microscopy Sciences	13512	Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom	Electron Microscopy Sciences	16564	For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 45 PFA
ESD Worstation kit	Elmstat	WSKK5324SB	Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded	Thorlabs	HCA3	Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort	Thorlabs	PAF-X-5-A	FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm	Fine Science Tools	14028-10
GFAP Antibody, rat	Thermo Fisher Scientific	13-0300
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000	For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Iodine Prep Pads	Medx Supple	MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Laser Safety Glasses	Thorlabs	LG10B	Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck	United Scope	LED-11C
Medical USP Grade Oxygen	Airgas	OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade	Intefra Miltex	V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer	Harvard aparatus	72-6110
Mini-pump variable flow	Thomas Scientific	70730-064	Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm	Kent Scientific	RBMA-200c	For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Control Box	Chemyx	10050
Nanojet pump header	Chemxy	10051	Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch	Fishcer Scientific	NC9459562
Non-rupture ear bars 60º	Kopf Instruments	922
PBS buffer pH 7.4	VWR	97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin	Thorlabs	LP520-MF100
Positive charge glass slides	Hareta	AHS90-WH
Power engergy meter	Thorlabs	PM100D	Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rectal Probe Mouse	kopf Instruments	Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%	Sigma-Aldrich	330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth	Kopf Instruments	1770-02	For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor	Thorlabs	S130VC	Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining	Thorlabs	CP02	For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL	VWR	10002-726	To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	For staining slides
Sterotaxic device	Kopf Instruments	940	Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1×2 teeth	Fine Science Tools	91127-12
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks	Fine Science Tools	91113-10
Temperature Controller	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound	VWR	25608-930
Triton X-100	VWR	97063-864
Upper Bracket Clamp	Kopf Instruments	1770-c	For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931
Vogue Professional My Manicurist	Bargin Source	6400	For Burrs
VWR Bead Sterilizers	VWR	75999-328
Tissue Tek OCT compound	Sakura	4583	For tissue embeding