Slagtilfælde er et globalt problem med minimale behandlingsmuligheder og ingen nuværende klinisk behandling for regenerering af det tabte hjernevæv. Her beskriver vi metoder til at skabe præcise fotothrombotic slagtilfælde i den motoriske cortex af gnavere og efterfølgende injektion af hydrogel biomaterialer til at studere deres virkninger på væv regenerering efter slagtilfælde.
Stroke er den hyppigste årsag til handicap og den femtestørste dødsårsag i USA. Ca. 87% af alle slagtilfælde er iskæmiske slagtilfælde og defineres som den pludselige blokering af et fartøj, der leverer blod til hjernen. Få minutter efter blokeringen begynder cellerne at dø og resultere i uoprettelige vævsskader. Nuværende terapeutiske behandlinger fokuserer på fjernelse af blodpropper eller lysis for at give mulighed for reperfusion og forhindre mere alvorlige hjerneskader. Selv om forbigående hjernen plasticitet kan redde nogle af de beskadigede væv over tid, betydelige fraktioner af patienter er tilbage med neurologiske underskud, der aldrig vil løse. Der er mangel på terapeutiske muligheder for at behandle neurologiske underskud forårsaget af slagtilfælde, understreger behovet for at udvikle nye strategier til behandling af denne voksende patientpopulation. Injicerbare biomaterialer er i øjeblikket ved at blive designet til at forbedre hjernens plasticitet og forbedre endogene reparation gennem levering af aktive stoffer eller stamceller. En metode til at teste disse tilgange er at udnytte en gnaver slagtilfælde model, injicere biomaterialet i slagtilfælde kerne, og vurdere reparation. Kendskab til den præcise placering af slagtilfælde kerne er bydende nødvendigt for den nøjagtige behandling efter slagtilfælde, derfor, et slagtilfælde model, der resulterer i en forudsigelig slagtilfælde placering er at foretrække at undgå behovet for billeddannelse før injektion. Følgende protokol vil dække, hvordan man fremkalder et fotothrombotisk slagtilfælde, hvordan man injicerer en hydrogel på en kontrolleret og præcis måde, og hvordan man ekstraherer og kryosection hjernen samtidig med at biomaterialet forbliver intakt. Derudover vil vi fremhæve, hvordan de samme hydrogelmaterialer kan bruges til samlevering af stamceller. Denne protokol kan generaliseres til brug af andre injicerbare biomaterialer i slagtilfældekernen.
Stroke er den hyppigste årsag til handicap og den femte hyppigste dødsårsag i USA1. Ca. 87% af alle slagtilfælde er iskæmiske, mens størstedelen af de resterende 13% er hæmoragiske2. En iskæmisk slagtilfælde er defineret som blokering af blodgennemstrømningen i en arterie til det omgivende væv. Denne okklusion resulterer i iltmangel og efterfølgende nekrose, der ofte fører til permanent handicap hos overlevende patienter. Mens der har været et fald i dødeligheden af slagtilfælde3, forventes dens udbredelse at stige til 3,4 millioner mennesker i 20304. Denne stigning i handicappede overlevende og deraf følgende økonomiske byrde har ført til et skub til slagtilfælde forskning, der fokuserer på mekanismer for neural reparation. Efter slagtilfælde er der en inflammatorisk periode, der fører til dannelsen af et ar, der forhindrer den nekrotiske region i at udvide sig. Regionen omkring den nekrotiske kerne kaldes “peri-infarct”, og der er et stærkt bevis for, at plasticiteten i denne region, som omfatter øget angiogenese, neurogenese og axonal spiring, er direkte forbundet med den observerede genopretning i dyremodeller og mennesker5. Da der ikke er nogen in vitro-modeller, der korrekt kan replikere de komplekse interaktioner efter slagtilfælde, er dyremodeller afgørende for slagtilfældeforskning.
Der er flere in vivo modeller, der kan bruges til at producere iskæmisk slagtilfælde. En af de mest almindelige modeller, der anvendes i mus er midten cerebral arterie okklusion, eller MCAo, gennem distale eller proksimale (via intra-arteriel glødetråd) okklusion. Den proksimale model, også kendt som glødetråd MCAo (fMCAo), typisk resulterer i store iskæmiske slagtilfælde, der omfatter overalt fra 5% til 50% af hjernehalvdelen, afhængig af antallet af faktorer6. I disse modeller, en sutur eller glødetråd er avanceret fra den indre halspulsåren i bunden af den midterste cerebral arterie (MCA) og holdes på plads i en bestemt periode. Denne metode til okklusion, som kan gøres midlertidig eller permanent, producerer en infarkt, der er centreret i striatum og måske eller måske ikke indebærer overlying cortex6. Den resulterende slagtilfælde størrelse er meget variabel, og billeddannelse teknikker, såsom laser doppler, er forpligtet til at bekræfte effektiviteten af proceduren i hver mus. Intra-arteriel eller intra-luminal glødetråd okklusion, der varer mere end 30 minutter producerer slagtilfælde i den større ende af størrelsesområdet. Nogle efterforskere har fokuseret på kortere glødetråd okklusion gange, som kræver betydelige eksperimentelle fokus og lab validering7. Filament MCAo modeller i mus følger lignende stadier af celledød, iskæmisk progression, og dannelsen af en peri-infarct region som set i human slagtilfælde tilfælde; men de større slagtilfælde ligner mere sygdomstilstanden af ondartede cerebrale infarkter, som er mindre almindelige, mindre behandlelige menneskelige slagtilfælde6. I mellemtiden, distale MCA okklusion kræver en mere involveret kirurgi og craniectomy. I denne model, den distale del af MCA, der løber langs overfladen af hjernen er direkte okkluderet med en sutur slips eller cauterization. I nogle variationer af teknikken er halspulsårerne ensidigt eller forbigående bilateralt okkluderet. En fordel ved den distale MCAo er, at det producerer en kortikale-baseret slagtilfælde, der er mindre variabel i størrelse end glødetråd model. Men den distale model producerer dårligere adfærdsmæssige output på grund af transection af den eksterne halspulsåren (ECA), som også er et problem med fMCAo6.
En alternativ slagtilfælde model, der er kendt for at være mindre invasiv er photothrombotic (PT) model. PT-modellen resulterer i en veldefineret placering af iskæmi og er forbundet med en høj overlevelsesrate8. Teknikken er afhængig af et lysfølsomt farvestof injiceres intraperitoneally, der giver mulighed for intravaskulær fotooxidation blot ved at bestråle det ønskede væv med en lys eller laser9. Ved excitation dannes iltradikaler, der forårsager endotelskader, som aktiverer blodpladeaggregation og blodpropdannelse i det bestrålede område8,9. Den stramme kontrol over slagtilfælde størrelse og placering, samt høj reproducerbarhed af PT-modellen, gør den ideel til at studere biomaterialer. Mens præcision er muliggjort ved hjælp af en laser og stereotaxiske koordinater, der er nogle ulemper, der kan gøre denne model mindre ideel til få undersøgelser. I modsætning til fMCAo-modellen kan PT-stregmodellen ikke reperfused. Derfor ville materialer til undersøgelse af neuroprotektive midler, der er specifikke for skader efter reperfusion eller mekanismerne efter reperfusion, ikke være nyttige her8. Derudover ses relativt lille iskæmisk penumbra på grund af PT-modellens mikrovaskulære fornærmelse. I stedet opstår lokale vasogene ødem, hvilket er ukarakteristisk for human slagtilfælde, hvilket gør denne model uønsket for prækliniske lægemiddelundersøgelser med fokus på det peri-infarct område6,8.
Det overordnede mål med biomateriale strategier i slagtilfælde er at enten levere bioaktive midler eller til at fungere som en surrogat ekstracellulær matrix for hjernevæv vækst. En strategi, som vi vil udforske ved hjælp af vores metoder, er at levere hydrogel direkte ind i slagtilfældekernen i modsætning til peri-infarktvævet, hvor mange nuværende celleterapier leveres10. Begrundelsen for denne tilgang er, at levering i det nekrotiske væv, der findes i kernen, vil undgå at forstyrre det omgivende sunde eller genoprettende væv. Vi antager, at diffusion af alle aktive stoffer, der indgår i biomaterialet, vil være i stand til at nå peri-infarct fra kernen, især da vi finder ud af, at levering af hydrogel biomaterialer reducerer tykkelsen af glial ar11. Dette er vigtigt, da peri-infarct regionen har vist sig at udvise neuroplasticitet efter slagtilfælde, hvilket gør det til et attraktivt mål. Desuden kan levering af en surrogatmatrix til stregkernen indlæses med angiogen12 eller neurogene13 faktorer til at guide dannelsen af nyt væv samt celler til levering14. Celle levering er stærkt forbedret ved hjælp af en matrix, fordi det beskytter celler fra de barske injektion kræfter og lokale miljø til stede under fødslen, samt tilskynder differentiering og indpodning15.
Disse injicerbare terapeutiske biomaterialer har klinisk relevans i slagtilfælde applikationer, da der i øjeblikket ikke er nogen medicinske behandlinger, der stimulerer neuronal genopretning efter slagtilfælde. De underliggende neurale kredsløb involveret i nyttiggørelse ligger i hjernevæv, der støder op tilslagtilfældekernen 16, mens selve slagtilfældekernen er blottet for levedygtigt neuralt væv. Vi forventer, at levere et biomateriale i nekrotiske slagtilfælde kerne har potentiale til at stimulere det tilstødende væv mod regenerative processer gennem en række mekanismer tidligere nævnt, herunder depot frigivelse af vækstfaktorer13,stimulering af væv in-vækst og fremme af inddrive hjernevæv udvikling11,12, ændring af immunrespons17, og levering af stamcelle-afledte terapeutiske14, 18. For effektivt at undersøge muligheden for disse anvendelser er der imidlertid behov for en konsekvent og reproducerbar metode til fremstilling af slagtilfælde og injektion af biomaterialer. PT-stregmodellen bruger teknikker, der giver præcis kontrol over slagtilfældets retning og placering. En laser, der er fastgjort til den stereotaxiske enhed, styrer retninger, og pumper, der er fastgjort til de stereotaxiske enheder, styrer materialets injektionshastighed uden behov for yderligere former for billeddannelse. Derfor har vi valgt at beskrive metoderne til at udføre et PT-slagtilfælde i musenes motoriske cortexer og til injektion af biomaterialer i slagkernen. Her bruger vi mikroporøse annealed partikel (MAP) hydrogels som biomateriale til injektion uden tilsatte celler eller vækstfaktorer. Derudover forklarer vi, hvordan man med succes kan hente hjernen med intakt biomateriale, og vi diskuterer immunkemi assays bruges til at analysere slagtilfælde resultatet med og uden injektion af biomaterialer.
Her demonstrerer vi en let reproducerbar, minimalt invasiv, permanent slagtilfælde model og beskrive, hvordan man injicerer et biomateriale i infarkt fem dage efter slagtilfælde. Brugen af fotothrombotic farvestof Rose Bengal og en 520 nm kolieret laser tilsluttet den stereotaxiske enhed giver os mulighed for at placere slagtilfælde på motoren cortex af musen med forbedret præcision. Fem dage efter slagtilfælde er infarktens placering synlig for øjet i midten af bestråling, 2,0 mm medio-lateral til bregmaen. Hydr…
The authors have nothing to disclose.
Vi kan godt lide at anerkende National Institutes of Health og National Institute of Neurologiske Lidelser og Stroke for finansiering (R01NS079691).
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |