Beroerte is een wereldwijd probleem met minimale behandelingsopties en geen huidige klinische therapie voor het regenereren van het verloren hersenweefsel. Hier beschrijven we methoden voor het creëren van een nauwkeurige fototrombotische beroerte in de motorische cortex van knaagdieren en daaropvolgende injectie van hydrogel-biomaterialen om hun effecten op weefselregeneratie na een beroerte te bestuderen.
Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Ongeveer 87% van alle beroertes zijn ischemische beroertes en worden gedefinieerd als de plotselinge verstopping van een vat dat bloed naar de hersenen levert. Binnen enkele minuten na de blokkade beginnen cellen af te sterven en resulteren in onherstelbare weefselschade. De huidige therapeutische behandelingen richten zich op het verwijderen van stolsels of lysis om de reperfusie mogelijk te maken en ernstiger hersenletsel te voorkomen. Hoewel voorbijgaande hersenplasticiteit een deel van het beschadigde weefsel in de loop van de tijd kan redden, blijven aanzienlijke fracties van patiënten achter met neurologische tekorten die nooit zullen verdwijnen. Er is een gebrek aan therapeutische opties om neurologische tekorten veroorzaakt door een beroerte te behandelen, met de nadruk op de noodzaak om nieuwe strategieën te ontwikkelen om deze groeiende patiëntenpopulatie te behandelen. Injecteerbare biomaterialen worden momenteel ontworpen om de plasticiteit van de hersenen te verbeteren en het endogene herstel te verbeteren door de afgifte van actieve stoffen of stamcellen. Een methode om deze benaderingen te testen, is door een knaagdierslagmodel te gebruiken, het biomateriaal in de beroertekern te injecteren en de reparatie te beoordelen. Het kennen van de exacte locatie van de beroertekern is noodzakelijk voor de nauwkeurige behandeling na een beroerte, daarom heeft een beroertemodel dat resulteert in een voorspelbare beroertelocatie de voorkeur om de noodzaak van beeldvorming voorafgaand aan injectie te voorkomen. Het volgende protocol behandelt hoe een fototrombotische beroerte kan worden geïnduceerd, hoe een hydrogel op een gecontroleerde en nauwkeurige manier kan worden geïnjecteerd en hoe de hersenen kunnen worden geëxtraheerd en gecryopteerd terwijl het biomateriaal intact blijft. Daarnaast zullen we belichten hoe dezelfde hydrogelmaterialen kunnen worden gebruikt voor de co-afgifte van stamcellen. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar het gebruik van andere injecteerbare biomaterialen in de slagkern.
Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten1. Ongeveer 87% van alle beroertes zijn ischemisch, terwijl een meerderheid van de resterende 13% hemorragisch is2. Een ischemische beroerte wordt gedefinieerd als de blokkering van de bloedstroom in een slagader naar het omliggende weefsel. Deze occlusie resulteert in zuurstofgebrek en daaropvolgende necrose die vaak leidt tot permanente invaliditeit bij overlevende patiënten. Hoewel er een daling is geweest in het sterftecijfer van beroerte3,zal de prevalentie ervan naar verwachting toenemen tot 3,4 miljoen mensen in 20304. Deze toename van gehandicapte overlevenden en de daaruit voortvloeiende economische last heeft geleid tot een push voor beroerte-onderzoek dat zich richt op mechanismen van neuraal herstel. Na een beroerte is er een ontstekingsperiode die leidt tot de vorming van een litteken dat voorkomt dat het necrotische gebied zich uitbreidt. Het gebied rond de necrotische kern wordt “peri-infarct” genoemd en er is een sterk bewijs dat de plasticiteit in deze regio, die verhoogde angiogenese, neurogenese en axonale kieming omvat, direct verband houdt met het waargenomen herstel in diermodellen en mensen5. Omdat er geen in vitro modellen zijn die de complexe interacties na een beroerte goed kunnen repliceren, zijn diermodellen essentieel voor beroerteonderzoek.
Er zijn verschillende in vivo modellen die kunnen worden gebruikt om ischemische beroerte te produceren. Een van de meest voorkomende modellen die bij muizen worden gebruikt, is occlusie van de middelste hersenslagader, of MCAo, door distale of proximale (via intra-arteriële filament) occlusie. Het proximale model, ook bekend als filament MCAo (fMCAo), resulteert meestal in grote ischemische beroertes die overal van 5% tot 50% van de hersenhelft omvatten, afhankelijk van het aantal factoren6. In deze modellen wordt een hechtdraad of filament van de interne halsslagader naar de basis van de middelste hersenslagader (MCA) gebracht en gedurende een bepaalde periode op zijn plaats gehouden. Deze methode voor occlusie, die tijdelijk of permanent kan worden gemaakt, produceert een infarct dat is gecentreerd in het striatum en al dan niet bovenliggende cortex kan omvatten6. De resulterende slaggrootte is zeer variabel en beeldvormingstechnieken, zoals laserdoppler, zijn vereist om de effectiviteit van de procedure bij elke muis te bevestigen. Intra-arteriële of intra-luminale filament occlusie die langer dan 30 minuten duurt, produceert slagen aan de grotere kant van het groottebereik. Sommige onderzoekers hebben zich gericht op kortere filamentocclusietijden, die aanzienlijke experimentele focus en laboratoriumvalidatie vereisen7. Filament MCAo-modellen bij muizen volgen vergelijkbare stadia van celdood, ischemische progressie en vorming van een peri-infarctgebied zoals gezien in gevallen van menselijke beroerte; de grotere beroertes lijken echter meer op de ziektetoestand van kwaadaardige herseninfarcten, die minder vaak voorkomen, minder behandelbare menselijke beroertes6. Ondertussen vereist distale MCA-occlusie een meer betrokken operatie en craniectomie. In dit model wordt het distale deel van de MCA dat langs het oppervlak van de hersenen loopt direct afgesloten met een hechtingsband of cauterisatie. In sommige variaties van de techniek zijn de halsslagaders eenzijdig of tijdelijk bilateraal afgesloten. Een voordeel van de distale MCAo is dat het een corticale slag produceert die minder variabel is in grootte dan het filamentmodel. Het distale model produceert echter een slechtere gedragsoutput als gevolg van transsectie van de externe halsslagader (ECA), wat ook een probleem is met fMCAo6.
Een alternatief beroertemodel dat bekend staat als minder invasief is het fototrombotische (PT) model. Het PT-model resulteert in een goed gedefinieerde locatie van ischemie en is geassocieerd met een hoge overlevingskans8. De techniek is gebaseerd op een lichtgevoelige kleurstof die intraperitoneaal wordt geïnjecteerd en die de intravasculaire foto-oxidatie mogelijk maakt door eenvoudigweg het gewenste weefsel met een licht of laser te bestralen9. Bij excitatie worden zuurstofradicalen gevormd die endotheelschade veroorzaken, die de aggregatie van bloedplaatjes en stolselvorming in het bestraalde gebiedactiveert 8,9. De strakke controle over slaggrootte en -locatie, evenals de hoge reproduceerbaarheid van het PT-model, maakt het ideaal voor het bestuderen van biomaterialen. Hoewel precisie mogelijk wordt gemaakt met behulp van een laser en stereotaxische coördinaten, zijn er enkele nadelen die dit model minder ideaal kunnen maken voor weinig studies. In tegenstelling tot het fMCAo-model kan het PT-beroertemodel niet worden gereperfuseerd. Daarom zouden materialen voor het onderzoeken van neuroprotectieve middelen die specifiek zijn voor schade na reperfusie of de mechanismen na reperfusie hier niet nuttig zijn8. Bovendien wordt door de microvasculaire belediging van het PT-model relatief kleine ischemische penumbra gezien. In plaats daarvan treedt lokaal vasogeen oedeem op, wat niet kenmerkend is voor een menselijke beroerte, waardoor dit model ongewenst is voor preklinische geneesmiddelenstudies gericht op het peri-infarctgebied6,8.
Het algemene doel van biomateriaalstrategieën bij beroerte is om bioactieve stoffen te leveren of om te fungeren als een surrogaat extracellulaire matrix voor de groei van hersenweefsel. Een strategie die we zullen onderzoeken met behulp van onze methoden is om hydrogel rechtstreeks in de beroertekern af te leveren, in tegenstelling tot het peri-infarctweefsel waar veel huidige celtherapieën worden geleverd10. De reden voor deze aanpak is dat levering in het necrotische weefsel in de kern zal voorkomen dat het omliggende gezonde of herstellende weefsel wordt verstoord. We gaan ervan uit dat diffusie van alle actieve stoffen die in het biomateriaal zijn opgenomen, het peri-infarct vanuit de kern kunnen bereiken, vooral omdat we vinden dat de afgifte van hydrogel-biomaterialen de dikte van het gliale litteken vermindert11. Dit is belangrijk omdat is aangetoond dat het peri-infarctgebied neuroplasticiteit vertoont na een beroerte, waardoor het een aantrekkelijk doelwit is. Bovendien kan de levering van een surrogaatmatrix aan de beroertekern worden geladen met angiogene12 of neurogene13 factoren om de vorming van nieuw weefsel te begeleiden, evenals cellen voor de bevalling14. De celafgifte wordt sterk verbeterd door het gebruik van een matrix omdat het cellen beschermt tegen de harde injectiekrachten en de lokale omgeving die aanwezig zijn tijdens de bevalling, en differentiatie en engraftment aanmoedigt15.
Deze injecteerbare therapeutische biomaterialen hebben klinische relevantie in beroertetoepassingen, omdat er momenteel geen medische therapieën zijn die neuronaal herstel na een beroerte stimuleren. De onderliggende neurale circuits die betrokken zijn bij herstel liggen in hersenweefsel dat grenst aan de beroertekern16, terwijl de beroertekern zelf verstoken is van levensvatbaar neuraal weefsel. We verwachten dat het leveren van een biomateriaal in de necrotische beroertekern potentieel heeft om het aangrenzende weefsel te stimuleren in de richting van regeneratieve processen via een aantal eerder genoemde mechanismen, waaronder depotafgifte van groeifactoren13, stimulatie van weefselgroei en bevordering van herstel van de ontwikkeling van hersenweefsel11,12, verandering van immuunresponsen17en levering van van stamcellen afgeleide therapeutica14, 18. Om de mogelijkheid van deze toepassingen effectief te bestuderen, is echter een consistente en reproduceerbare methode nodig voor het induceren van een beroerte en het injecteren van biomaterialen. Het PT-slagmodel maakt gebruik van technieken die nauwkeurige controle bieden over de oriëntatie en locatie van de slag. Een laser die aan het stereotaxische apparaat is bevestigd, leidt oriëntaties en pompen die aan de stereotaxische apparaten zijn bevestigd, regelen de injectiesnelheid van het materiaal zonder dat aanvullende vormen van beeldvorming nodig zijn. Daarom hebben we ervoor gekozen om de methoden te beschrijven voor het uitvoeren van een PT-beroerte in de motorische cortex van muizen en voor het injecteren van biomaterialen in de slagkern. Hier gebruiken we microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) hydrogels als biomateriaal voor injectie zonder toegevoegde cellen of groeifactoren. Daarnaast leggen we uit hoe we de hersenen met succes kunnen ophalen met intact biomateriaal en bespreken we immunochemische testen die worden gebruikt om de uitkomst van de beroerte met en zonder injectie van biomaterialen te analyseren.
Hier demonstreren we een gemakkelijk reproduceerbaar, minimaal invasief, permanent beroertemodel en beschrijven we hoe een biomateriaal vijf dagen na de beroerte in het infarct kan worden geïnjecteerd. Het gebruik van de fototrombotische kleurstof Rose Bengal en een 520 nm gecollimeerde laser verbonden met het stereotaxische apparaat geeft ons de mogelijkheid om de slag op de motorische cortex van de muis met verbeterde precisie te positioneren. Vijf dagen na de beroerte is de locatie van het infarct met het oog zichtba…
The authors have nothing to disclose.
We erkennen graag de National Institutes of Health en het National Institute of Neurological Disorders and Stroke voor financiering (R01NS079691).
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |