Injectie van Hydrogel Biomaterial Steigers naar de hersenen na een beroerte

Summary

Beroerte is een wereldwijd probleem met minimale behandelingsopties en geen huidige klinische therapie voor het regenereren van het verloren hersenweefsel. Hier beschrijven we methoden voor het creëren van een nauwkeurige fototrombotische beroerte in de motorische cortex van knaagdieren en daaropvolgende injectie van hydrogel-biomaterialen om hun effecten op weefselregeneratie na een beroerte te bestuderen.

Abstract

Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Ongeveer 87% van alle beroertes zijn ischemische beroertes en worden gedefinieerd als de plotselinge verstopping van een vat dat bloed naar de hersenen levert. Binnen enkele minuten na de blokkade beginnen cellen af te sterven en resulteren in onherstelbare weefselschade. De huidige therapeutische behandelingen richten zich op het verwijderen van stolsels of lysis om de reperfusie mogelijk te maken en ernstiger hersenletsel te voorkomen. Hoewel voorbijgaande hersenplasticiteit een deel van het beschadigde weefsel in de loop van de tijd kan redden, blijven aanzienlijke fracties van patiënten achter met neurologische tekorten die nooit zullen verdwijnen. Er is een gebrek aan therapeutische opties om neurologische tekorten veroorzaakt door een beroerte te behandelen, met de nadruk op de noodzaak om nieuwe strategieën te ontwikkelen om deze groeiende patiëntenpopulatie te behandelen. Injecteerbare biomaterialen worden momenteel ontworpen om de plasticiteit van de hersenen te verbeteren en het endogene herstel te verbeteren door de afgifte van actieve stoffen of stamcellen. Een methode om deze benaderingen te testen, is door een knaagdierslagmodel te gebruiken, het biomateriaal in de beroertekern te injecteren en de reparatie te beoordelen. Het kennen van de exacte locatie van de beroertekern is noodzakelijk voor de nauwkeurige behandeling na een beroerte, daarom heeft een beroertemodel dat resulteert in een voorspelbare beroertelocatie de voorkeur om de noodzaak van beeldvorming voorafgaand aan injectie te voorkomen. Het volgende protocol behandelt hoe een fototrombotische beroerte kan worden geïnduceerd, hoe een hydrogel op een gecontroleerde en nauwkeurige manier kan worden geïnjecteerd en hoe de hersenen kunnen worden geëxtraheerd en gecryopteerd terwijl het biomateriaal intact blijft. Daarnaast zullen we belichten hoe dezelfde hydrogelmaterialen kunnen worden gebruikt voor de co-afgifte van stamcellen. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar het gebruik van andere injecteerbare biomaterialen in de slagkern.

Introduction

Beroerte is de belangrijkste oorzaak van invaliditeit en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten¹. Ongeveer 87% van alle beroertes zijn ischemisch, terwijl een meerderheid van de resterende 13% hemorragisch is². Een ischemische beroerte wordt gedefinieerd als de blokkering van de bloedstroom in een slagader naar het omliggende weefsel. Deze occlusie resulteert in zuurstofgebrek en daaropvolgende necrose die vaak leidt tot permanente invaliditeit bij overlevende patiënten. Hoewel er een daling is geweest in het sterftecijfer van beroerte^3,zal de prevalentie ervan naar verwachting toenemen tot 3,4 miljoen mensen in 2030⁴. Deze toename van gehandicapte overlevenden en de daaruit voortvloeiende economische last heeft geleid tot een push voor beroerte-onderzoek dat zich richt op mechanismen van neuraal herstel. Na een beroerte is er een ontstekingsperiode die leidt tot de vorming van een litteken dat voorkomt dat het necrotische gebied zich uitbreidt. Het gebied rond de necrotische kern wordt “peri-infarct” genoemd en er is een sterk bewijs dat de plasticiteit in deze regio, die verhoogde angiogenese, neurogenese en axonale kieming omvat, direct verband houdt met het waargenomen herstel in diermodellen en mensen⁵. Omdat er geen in vitro modellen zijn die de complexe interacties na een beroerte goed kunnen repliceren, zijn diermodellen essentieel voor beroerteonderzoek.

Er zijn verschillende in vivo modellen die kunnen worden gebruikt om ischemische beroerte te produceren. Een van de meest voorkomende modellen die bij muizen worden gebruikt, is occlusie van de middelste hersenslagader, of MCAo, door distale of proximale (via intra-arteriële filament) occlusie. Het proximale model, ook bekend als filament MCAo (fMCAo), resulteert meestal in grote ischemische beroertes die overal van 5% tot 50% van de hersenhelft omvatten, afhankelijk van het aantal factoren⁶. In deze modellen wordt een hechtdraad of filament van de interne halsslagader naar de basis van de middelste hersenslagader (MCA) gebracht en gedurende een bepaalde periode op zijn plaats gehouden. Deze methode voor occlusie, die tijdelijk of permanent kan worden gemaakt, produceert een infarct dat is gecentreerd in het striatum en al dan niet bovenliggende cortex kan omvatten⁶. De resulterende slaggrootte is zeer variabel en beeldvormingstechnieken, zoals laserdoppler, zijn vereist om de effectiviteit van de procedure bij elke muis te bevestigen. Intra-arteriële of intra-luminale filament occlusie die langer dan 30 minuten duurt, produceert slagen aan de grotere kant van het groottebereik. Sommige onderzoekers hebben zich gericht op kortere filamentocclusietijden, die aanzienlijke experimentele focus en laboratoriumvalidatie vereisen⁷. Filament MCAo-modellen bij muizen volgen vergelijkbare stadia van celdood, ischemische progressie en vorming van een peri-infarctgebied zoals gezien in gevallen van menselijke beroerte; de grotere beroertes lijken echter meer op de ziektetoestand van kwaadaardige herseninfarcten, die minder vaak voorkomen, minder behandelbare menselijke beroertes⁶. Ondertussen vereist distale MCA-occlusie een meer betrokken operatie en craniectomie. In dit model wordt het distale deel van de MCA dat langs het oppervlak van de hersenen loopt direct afgesloten met een hechtingsband of cauterisatie. In sommige variaties van de techniek zijn de halsslagaders eenzijdig of tijdelijk bilateraal afgesloten. Een voordeel van de distale MCAo is dat het een corticale slag produceert die minder variabel is in grootte dan het filamentmodel. Het distale model produceert echter een slechtere gedragsoutput als gevolg van transsectie van de externe halsslagader (ECA), wat ook een probleem is met fMCAo⁶.

Een alternatief beroertemodel dat bekend staat als minder invasief is het fototrombotische (PT) model. Het PT-model resulteert in een goed gedefinieerde locatie van ischemie en is geassocieerd met een hoge overlevingskans⁸. De techniek is gebaseerd op een lichtgevoelige kleurstof die intraperitoneaal wordt geïnjecteerd en die de intravasculaire foto-oxidatie mogelijk maakt door eenvoudigweg het gewenste weefsel met een licht of laser te bestralen⁹. Bij excitatie worden zuurstofradicalen gevormd die endotheelschade veroorzaken, die de aggregatie van bloedplaatjes en stolselvorming in het bestraalde gebied^{activeert 8,9}. De strakke controle over slaggrootte en -locatie, evenals de hoge reproduceerbaarheid van het PT-model, maakt het ideaal voor het bestuderen van biomaterialen. Hoewel precisie mogelijk wordt gemaakt met behulp van een laser en stereotaxische coördinaten, zijn er enkele nadelen die dit model minder ideaal kunnen maken voor weinig studies. In tegenstelling tot het fMCAo-model kan het PT-beroertemodel niet worden gereperfuseerd. Daarom zouden materialen voor het onderzoeken van neuroprotectieve middelen die specifiek zijn voor schade na reperfusie of de mechanismen na reperfusie hier niet nuttig zijn⁸. Bovendien wordt door de microvasculaire belediging van het PT-model relatief kleine ischemische penumbra gezien. In plaats daarvan treedt lokaal vasogeen oedeem op, wat niet kenmerkend is voor een menselijke beroerte, waardoor dit model ongewenst is voor preklinische geneesmiddelenstudies gericht op het peri-infarctgebied^6,8.

Het algemene doel van biomateriaalstrategieën bij beroerte is om bioactieve stoffen te leveren of om te fungeren als een surrogaat extracellulaire matrix voor de groei van hersenweefsel. Een strategie die we zullen onderzoeken met behulp van onze methoden is om hydrogel rechtstreeks in de beroertekern af te leveren, in tegenstelling tot het peri-infarctweefsel waar veel huidige celtherapieën worden geleverd¹⁰. De reden voor deze aanpak is dat levering in het necrotische weefsel in de kern zal voorkomen dat het omliggende gezonde of herstellende weefsel wordt verstoord. We gaan ervan uit dat diffusie van alle actieve stoffen die in het biomateriaal zijn opgenomen, het peri-infarct vanuit de kern kunnen bereiken, vooral omdat we vinden dat de afgifte van hydrogel-biomaterialen de dikte van het gliale litteken vermindert¹¹. Dit is belangrijk omdat is aangetoond dat het peri-infarctgebied neuroplasticiteit vertoont na een beroerte, waardoor het een aantrekkelijk doelwit is. Bovendien kan de levering van een surrogaatmatrix aan de beroertekern worden geladen met angiogene¹² of neurogene¹³ factoren om de vorming van nieuw weefsel te begeleiden, evenals cellen voor de bevalling¹⁴. De celafgifte wordt sterk verbeterd door het gebruik van een matrix omdat het cellen beschermt tegen de harde injectiekrachten en de lokale omgeving die aanwezig zijn tijdens de bevalling, en differentiatie en engraftment aanmoedigt¹⁵.

Deze injecteerbare therapeutische biomaterialen hebben klinische relevantie in beroertetoepassingen, omdat er momenteel geen medische therapieën zijn die neuronaal herstel na een beroerte stimuleren. De onderliggende neurale circuits die betrokken zijn bij herstel liggen in hersenweefsel dat grenst aan de beroertekern¹⁶, terwijl de beroertekern zelf verstoken is van levensvatbaar neuraal weefsel. We verwachten dat het leveren van een biomateriaal in de necrotische beroertekern potentieel heeft om het aangrenzende weefsel te stimuleren in de richting van regeneratieve processen via een aantal eerder genoemde mechanismen, waaronder depotafgifte van groeifactoren¹³, stimulatie van weefselgroei en bevordering van herstel van de ontwikkeling van hersenweefsel^11,12, verandering van immuunresponsen¹⁷en levering van van stamcellen afgeleide therapeutica^{14, 18}. Om de mogelijkheid van deze toepassingen effectief te bestuderen, is echter een consistente en reproduceerbare methode nodig voor het induceren van een beroerte en het injecteren van biomaterialen. Het PT-slagmodel maakt gebruik van technieken die nauwkeurige controle bieden over de oriëntatie en locatie van de slag. Een laser die aan het stereotaxische apparaat is bevestigd, leidt oriëntaties en pompen die aan de stereotaxische apparaten zijn bevestigd, regelen de injectiesnelheid van het materiaal zonder dat aanvullende vormen van beeldvorming nodig zijn. Daarom hebben we ervoor gekozen om de methoden te beschrijven voor het uitvoeren van een PT-beroerte in de motorische cortex van muizen en voor het injecteren van biomaterialen in de slagkern. Hier gebruiken we microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) hydrogels als biomateriaal voor injectie zonder toegevoegde cellen of groeifactoren. Daarnaast leggen we uit hoe we de hersenen met succes kunnen ophalen met intact biomateriaal en bespreken we immunochemische testen die worden gebruikt om de uitkomst van de beroerte met en zonder injectie van biomaterialen te analyseren.

Protocol

De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met IUCAC aan de Duke University en de University of California Los Angeles. 8 tot 12 weken oude mannelijke C57Bl / 6J-muizen werden gebruikt in deze studie. De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde temperatuur (22 ± 2 °C), met een licht-donkercyclusperiode van 12 uur en toegang tot gepelletiseerd voedsel en water ad libitum. Analgesie- en sedatieprotocollen worden beschreven als goedgekeurd door de IUCAC, maar kunnen verschillen van protocollen die in andere…

Representative Results

Het doel van deze methode was om aan te tonen hoe biomaterialen in de hersenen kunnen worden geïnjecteerd na een beroerte. Een fototrombotisch model met rose bengal en een 520 nm laser werd gebruikt voor een gecontroleerde oriëntatie van de beroerte laesie in zowel grootte als locatie. Vijf dagen na een beroerte kon het infarct worden gevisualiseerd tijdens de operatie(figuur 1B)en door TTC en beeldvorming van IHC-gekleurde dia’s(figuur 2). Een toename van de …

Discussion

Hier demonstreren we een gemakkelijk reproduceerbaar, minimaal invasief, permanent beroertemodel en beschrijven we hoe een biomateriaal vijf dagen na de beroerte in het infarct kan worden geïnjecteerd. Het gebruik van de fototrombotische kleurstof Rose Bengal en een 520 nm gecollimeerde laser verbonden met het stereotaxische apparaat geeft ons de mogelijkheid om de slag op de motorische cortex van de muis met verbeterde precisie te positioneren. Vijf dagen na de beroerte is de locatie van het infarct met het oog zichtba…

Materials

10% Normal Goat Serum	VWR	100504-028	For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium	Medline	MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle	Fishcer Scientific	14824663	Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette	Gilson	M-25
2x Beam Expander, 400-650nm	Thorlabs	GBE02-A	Laser beam expander
Adjustable Stage Platform	Kopf Instruments	901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit	Abcam	ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat	abcam	ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12"	Medsupply	367294	For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil	Thorlabs	BKF12	To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2"	Sklar surgical instruments	64-2035
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664	8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter	Fine Science Tools	19007-05	For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate	VWR	EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers	Thorlabs	CLD1010LP
Cotton Swabs	VWR	89031-288
CP 25 pipette tips	Gilson	F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488)	abcam	ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647)	abcam	ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555)	abcam	ab150154
EMS DPX Mountant	Elecron Microscopy Sciences	13512	Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom	Electron Microscopy Sciences	16564	For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 45 PFA
ESD Worstation kit	Elmstat	WSKK5324SB	Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded	Thorlabs	HCA3	Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort	Thorlabs	PAF-X-5-A	FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm	Fine Science Tools	14028-10
GFAP Antibody, rat	Thermo Fisher Scientific	13-0300
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000	For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Iodine Prep Pads	Medx Supple	MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Laser Safety Glasses	Thorlabs	LG10B	Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck	United Scope	LED-11C
Medical USP Grade Oxygen	Airgas	OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade	Intefra Miltex	V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer	Harvard aparatus	72-6110
Mini-pump variable flow	Thomas Scientific	70730-064	Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm	Kent Scientific	RBMA-200c	For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Control Box	Chemyx	10050
Nanojet pump header	Chemxy	10051	Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch	Fishcer Scientific	NC9459562
Non-rupture ear bars 60º	Kopf Instruments	922
PBS buffer pH 7.4	VWR	97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin	Thorlabs	LP520-MF100
Positive charge glass slides	Hareta	AHS90-WH
Power engergy meter	Thorlabs	PM100D	Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rectal Probe Mouse	kopf Instruments	Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%	Sigma-Aldrich	330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth	Kopf Instruments	1770-02	For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor	Thorlabs	S130VC	Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining	Thorlabs	CP02	For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL	VWR	10002-726	To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	For staining slides
Sterotaxic device	Kopf Instruments	940	Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1×2 teeth	Fine Science Tools	91127-12
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks	Fine Science Tools	91113-10
Temperature Controller	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound	VWR	25608-930
Triton X-100	VWR	97063-864
Upper Bracket Clamp	Kopf Instruments	1770-c	For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931
Vogue Professional My Manicurist	Bargin Source	6400	For Burrs
VWR Bead Sterilizers	VWR	75999-328
Tissue Tek OCT compound	Sakura	4583	For tissue embeding