स्ट्रोक न्यूनतम उपचार विकल्प और खो मस्तिष्क ऊतक पुनर्जीवित करने के लिए कोई वर्तमान नैदानिक चिकित्सा के साथ एक वैश्विक मुद्दा है। यहां हम कृंतक के मोटर कॉर्टेक्स में सटीक फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक बनाने के तरीकों का वर्णन करते हैं और स्ट्रोक के बाद ऊतक पुनर्जनन पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए हाइड्रोजेल बायोमैटेरियल्स के बाद इंजेक्शन।
स्ट्रोक विकलांगता का प्रमुख कारण है और संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत का पांचवां प्रमुख कारण है । सभी स्ट्रोक के लगभग 87% इस्कीमिक स्ट्रोक हैं और मस्तिष्क को रक्त की आपूर्ति करने वाले पोत की अचानक रुकावट के रूप में परिभाषित किए जाते हैं। रुकावट के कुछ ही मिनटों के भीतर, कोशिकाएं मरने लगती हैं और परिणामस्वरूप अपूरणीय ऊतक क्षति होती है। वर्तमान चिकित्सीय उपचार थक्का हटाने या लाइसिस पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ईंधन के लिए अनुमति देते हैं और अधिक गंभीर मस्तिष्क क्षति को रोकने के लिए। हालांकि क्षणिक मस्तिष्क प्लास्टिसिटी समय के साथ क्षतिग्रस्त ऊतक के कुछ उबार सकता है, रोगियों के महत्वपूर्ण अंश न्यूरोलॉजिकल घाटे है कि हल कभी नहीं होगा के साथ छोड़ दिया जाता है । स्ट्रोक के कारण न्यूरोलॉजिकल घाटे का इलाज करने के लिए चिकित्सीय विकल्पों की कमी है, इस बढ़ती रोगी आबादी के इलाज के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता पर जोर दिया गया है। इंजेक्शन बायोमैटेरियल्स वर्तमान में मस्तिष्क प्लास्टिसिटी को बढ़ाने और सक्रिय एजेंटों या स्टेम सेल के वितरण के माध्यम से अंतर्जात मरम्मत में सुधार करने के लिए डिजाइन किया जा रहा है । इन दृष्टिकोणों का परीक्षण करने के लिए एक विधि कृंतक स्ट्रोक मॉडल का उपयोग करना, स्ट्रोक कोर में बायोमटेरियल इंजेक्ट करना और मरम्मत का आकलन करना है। स्ट्रोक कोर के सटीक स्थान को जानना स्ट्रोक के बाद सटीक उपचार के लिए जरूरी है, इसलिए, एक स्ट्रोक मॉडल जिसके परिणामस्वरूप अनुमानित स्ट्रोक स्थान इंजेक्शन से पहले इमेजिंग की आवश्यकता से बचने के लिए बेहतर है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में फोटोथ्रोम्बोटिक स्ट्रोक को कैसे प्रेरित किया जाए, नियंत्रित और सटीक तरीके से हाइड्रोगेल को कैसे इंजेक्ट किया जाए, और बायोमैटेरियल को बरकरार रखते हुए मस्तिष्क को कैसे निकाला और क्रायोसेक्शन किया जाए। इसके अलावा, हम इस बात पर प्रकाश डालेंगे कि स्टेम सेल के सह-वितरण के लिए इन हाइड्रोगेल सामग्रियों का उपयोग कैसे किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को स्ट्रोक कोर में अन्य इंजेक्शन बायोमैटेरियल्स के उपयोग के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है।
स्ट्रोक विकलांगता का प्रमुख कारण है और संयुक्त राज्य अमेरिका1में मौत का पांचवां प्रमुख कारण है । सभी स्ट्रोक के लगभग 87% इस्कीमिक हैं, जबकि शेष 13% में से अधिकांशरक्तस्रावी 2हैं। एक इस्कीमिक स्ट्रोक को आसपास के ऊतकों के लिए एक धमनी में रक्त प्रवाह की रुकावट के रूप में परिभाषित किया गया है। इस ऑक्सक्लूजन के परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की कमी और बाद में परिगलन होता है जो अक्सर जीवित रोगियों में स्थायी विकलांगता की ओर जाता है। जहां स्ट्रोक3की मृत्यु दर में कमी आई है , वहीं 20304तक इसकी व्यापकता बढ़कर 34 लाख लोगों तक बढ़ने की संभावना है . विकलांग बचे और परिणामी आर्थिक बोझ में यह वृद्धि स्ट्रोक अनुसंधान के लिए एक धक्का है कि तंत्रिका की मरंमत के तंत्र पर केंद्रित करने के लिए नेतृत्व किया गया है । स्ट्रोक के बाद एक भड़काऊ अवधि होती है जो एक निशान के गठन की ओर ले जाती है जो परिगलित क्षेत्र को विस्तार से रोकती है। परिगलित कोर के आसपास के क्षेत्र को “पेरी-इनफार्ट” कहा जाता है और इस बात का एक मजबूत सबूत है कि इस क्षेत्र में प्लास्टिसिटी, जिसमें एंजियोजेनेसिस, न्यूरोजेनेसिस और एक्सोनल स्प्राउटिंग शामिल हैं, सीधे पशु मॉडल और मनुष्य5में मनाया वसूली से जुड़ा हुआ है। चूंकि कोई इन विट्रो मॉडल नहीं है जो स्ट्रोक के बाद जटिल बातचीत को ठीक से दोहरा सकता है, इसलिए स्ट्रोक अनुसंधान के लिए पशु मॉडल आवश्यक हैं।
वीवो मॉडल में कई ऐसे हैं जिनका उपयोग इस्कीमिक स्ट्रोक का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है। चूहों में उपयोग किए जाने वाले सबसे आम मॉडलों में से एक मध्य मस्तिष्क धमनी ऑक्क्यूज़न, या एमसीएओ है, डिस्टल या समीपस्थ (अंतर-धमनी फिलामेंट के माध्यम से) ऑक्लूजन के माध्यम से। समीपस्थ मॉडल, जिसे फिलामेंट एमसीएओ (एफएमएओ) के रूप में भी जाना जाता है, आमतौर पर बड़े इस्कीमिक स्ट्रोक का परिणाम होता है जो सेरेब्रल गोलार्द्ध के 5% से 50% तक कहीं भी शामिल होते हैं,जो 6कारकों की संख्या पर निर्भर करते हैं। इन मॉडलों में, एक सीवन या फिलामेंट को आंतरिक कैरोटिड धमनी से मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) के आधार में उन्नत किया जाता है और एक विशिष्ट अवधि के लिए जगह में रखा जाता है। ऑक्सक्लूज़न के लिए यह विधि, जिसे अस्थायी या स्थायी बनाया जा सकता है, एक इनफारेक्ट का उत्पादन करता है जो स्ट्राटम में केंद्रित है और इसमें ओवरलिंग कॉर्टेक्स6शामिल हो सकता है या नहीं हो सकता है। परिणामस्वरूप स्ट्रोक का आकार अत्यधिक परिवर्तनशील है, और लेजर डॉप्लर जैसी इमेजिंग तकनीकों को प्रत्येक माउस में प्रक्रिया की प्रभावशीलता की पुष्टि करने की आवश्यकता होती है। इंट्रा-धमनी या इंट्रा-ल्यूमिनल फिलामेंट ऑक्लसियन जो 30 मिनट से अधिक रहता है, आकार सीमा के बड़े अंत में स्ट्रोक पैदा करता है। कुछ जांचकर्ताओं ने छोटे फिलामेंट ऑक्क्यूशन टाइम्स पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसके लिए पर्याप्त प्रायोगिक फोकस और लैब सत्यापन7की आवश्यकता होती है। चूहों में फिलामेंट एमसीएओ मॉडल सेल मृत्यु, इस्कीमिक प्रगति और मानव स्ट्रोक के मामलों में देखे गए पेरी-इनफाक्ट क्षेत्र के गठन के समान चरणों का पालन करते हैं; हालांकि, बड़ा स्ट्रोक अधिक बारीकी से घातक मस्तिष्क इंफार्क्शन, जो कम आम हैं, कम इलाज मानव स्ट्रोक6की रोग राज्य के समान . इस बीच, डिस्टल एमसीए ऑक्सीक्लूशन के लिए अधिक शामिल सर्जरी और क्रैनेक्टॉमी की आवश्यकता होती है। इस मॉडल में, मस्तिष्क की सतह के साथ चलने वाले एमसीए का डिस्टल हिस्सा सीधे सीवन टाई या कॉटराइजेशन के साथ होता है। तकनीक के कुछ रूपों में, कैरोटिड धमनियों को एकतरफा या क्षणिक-द्विपक्षीय रूप से ऑक्सीलेड किया जाता है। डिस्टल एमसीएओ का एक लाभ यह है कि यह एक कॉर्टिकल-आधारित स्ट्रोक पैदा करता है जो फिलामेंट मॉडल की तुलना में आकार में कम चरता है। हालांकि, डिस्टल मॉडल बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) के ट्रांसेक्शन के कारण खराब व्यवहार उत्पादन का उत्पादन करता है, जो एफएमएओ6के साथ भी चिंता का विषय है।
एक वैकल्पिक स्ट्रोक मॉडल है कि कम आक्रामक होने के लिए जाना जाता है फोटोथ्रोम्बोटिक (पीटी) मॉडल है । पीटी मॉडल इस्केमिया के एक अच्छी तरह से परिभाषित स्थान में परिणाम है और एक उच्च जीवित रहने की दर8के साथ जुड़ा हुआ है । यह तकनीक एक फोटोसेंसिटिव डाई पर निर्भर करती है जो इंट्रापेरिटोली इंजेक्ट की जाती है जो केवल एक प्रकाश या लेजर9के साथ वांछित ऊतक को विकिरणित करके इंट्रावैस्कुलर फोटो-ऑक्सीकरण के लिए अनुमति देती है। उत्तेजन पर, ऑक्सीजन कण बनते हैं जो एंडोथेलियल क्षति का कारण बनते हैं, जो विकिरणित क्षेत्र8, 9में प्लेटलेट एकत्रीकरण और थक्कागठनको सक्रिय करता है। स्ट्रोक के आकार और स्थान पर तंग नियंत्रण, साथ ही पीटी मॉडल की उच्च प्रजनन क्षमता, इसे बायोमैटेरियल्स का अध्ययन करने के लिए आदर्श बनाती है। जबकि सटीक एक लेजर और स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक का उपयोग करके संभव बनाया जाता है, कुछ नुकसान हैं जो इस मॉडल को कुछ अध्ययनों के लिए कम आदर्श बना सकते हैं। एफएमएओ मॉडल के विपरीत, पीटी स्ट्रोक मॉडल को फिर से तैयार नहीं किया जा सकता है। इसलिए , अनुर्फूधन के बाद नुकसान के लिए विशिष्ट न्यूरोप्रोटेक्टिव एजेंटों की जांच के लिए सामग्री या रिफ्यूजन के बाद तंत्र यहां उपयोगी नहीं होगा8. इसके अतिरिक्त, पीटी मॉडल के माइक्रोवैस्कुलर अपमान के कारण, अपेक्षाकृत छोटे इस्कीमिक पेनुम्ब्रा देखा जाता है। इसके बजाय, स्थानीय वासोजेनिक एडिमा होता है, जो मानव स्ट्रोक के लिए अस्वाभाविक है, जिससे इस मॉडल को प्रीक्लिनिकल दवा अध्ययनों के लिए अवांछनीय बना दिया गया हैजोपेरी-इनफार्क क्षेत्र6,8पर केंद्रित है।
स्ट्रोक में जैव सामग्री रणनीतियों का समग्र लक्ष्य या तो बायोएक्टिव एजेंटों को वितरित करना या मस्तिष्क के ऊतकों के विकास के लिए सरोगेट एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के रूप में कार्य करना है। एक रणनीति है कि हम अपने तरीकों का उपयोग कर का पता लगाने के लिए सीधे स्ट्रोक कोर में हाइड्रोगेल उद्धार है, के रूप में पेरी-infarct ऊतक जहां कई वर्तमान सेल चिकित्सा10दिया जाता है के खिलाफ है । इस दृष्टिकोण के लिए तर्क यह है कि कोर में पाए जाने वाले परिगलित ऊतक में डिलीवरी आसपास के स्वस्थ या ठीक ऊतक को बाधित करने से बचना होगा। हम मानते हैं कि बायोमटेरियल के भीतर शामिल किसी भी सक्रिय एजेंटों का प्रसार कोर से पेरी-इनफारेक्ट तक पहुंचने में सक्षम होगा, खासकर जब से हम पाते हैं कि हाइड्रोगेल बायोमैटेरियल्स की डिलीवरी ग्लियल निशान11की मोटाई को कम करती है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि पेरी-इनफार्ट क्षेत्र को स्ट्रोक के बाद न्यूरोप्लास्टी प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है, जिससे यह एक आकर्षक लक्ष्य बन गया है। इसके अलावा, स्ट्रोक कोर के लिए एक सरोगेट मैट्रिक्स की डिलीवरी एंजियोजेनिक12 या न्यूरोजेनिक13 कारकों के साथ लोड किया जा सकता है नए ऊतक के गठन का मार्गदर्शन करने के लिए, साथ ही प्रसव14के लिए कोशिकाओं । मैट्रिक्स का उपयोग करके सेल डिलीवरी को बहुत बढ़ाया जाता है क्योंकि यह डिलीवरी के दौरान मौजूद कठोर इंजेक्शन बलों और स्थानीय वातावरण से कोशिकाओं की रक्षा करता है, साथ ही भेदभाव और एनग्रेक्शन15को प्रोत्साहित करता है।
इन इंजेक्शन चिकित्सीय बायोमैटेरियल्स स्ट्रोक अनुप्रयोगों में नैदानिक प्रासंगिकता है, क्योंकि वर्तमान में कोई चिकित्सा उपचार नहीं है जो स्ट्रोक के बाद न्यूरोनल रिकवरी को प्रोत्साहित करते हैं। वसूली में शामिल अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट मस्तिष्क के ऊतकों में झूठ बोलते हैं जो स्ट्रोक कोर16से सटा हुआ है, जबकि स्ट्रोक कोर स्वयं व्यवहार्य तंत्रिका ऊतक से रहित है। हम आशा करते हैं कि गल-नाड़ुक स्ट्रोक कोर में बायोमटेरियल देने से पहले उल्लिखित कई तंत्रों के माध्यम से पुनर्योजी प्रक्रियाओं की ओर आसन्न ऊतक को उत्तेजित करने की क्षमता है, जिसमें विकास कारकों की डिपो रिलीज13,ऊतक की उत्तेजना और मस्तिष्क के ऊतकों के विकास को ठीक करने की पदोन्नति11,12,प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन17,और स्टेम सेल-व्युत्पन्न चिकित्सीय14कीडिलीवरी, 18. हालांकि, प्रभावी ढंग से इन अनुप्रयोगों की संभावना का अध्ययन करने के लिए, स्ट्रोक उत्प्रेरण और बायोमैटेरियल इंजेक्शन के लिए एक सुसंगत और प्रजनन विधि की जरूरत है । पीटी स्ट्रोक मॉडल तकनीकों का उपयोग करता है जो स्ट्रोक के अभिविन्यास और स्थान पर सटीक नियंत्रण प्रदान करते हैं। स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस से जुड़ा एक लेजर झुकाव को निर्देशित करता है, और स्टीरियोटैक्सिक उपकरणों से जुड़े पंप इमेजिंग के अतिरिक्त रूपों की आवश्यकता के बिना सामग्री की इंजेक्शन दर को नियंत्रित करते हैं। इसलिए, हमने चूहों के मोटर कॉर्टेक्स में पीटी स्ट्रोक प्रदर्शन करने और स्ट्रोक कोर में बायोमैटेरियल्स इंजेक्शन के लिए तरीकों का वर्णन करने के लिए चुना है। यहां, हम माइक्रोपोरस एनील्ड पार्टिकल (एमएपी) हाइड्रोगेल का उपयोग इंजेक्शन के लिए बायोमटेरियल के रूप में करते हैं जिसमें कोई अतिरिक्त कोशिकाएं या विकास कारक नहीं होते हैं। इसके अतिरिक्त, हम समझाते हैं कि मस्तिष्क को अक्षुण्ण बायोमैटेरियल के साथ सफलतापूर्वक कैसे पुनः प्राप्त किया जाए, और हम बायोमैटेरियल्स के इंजेक्शन के साथ और बिना स्ट्रोक के परिणाम का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले इम्यूनोकेमिस्ट्री पर चर्चा करते हैं।
यहां हम एक आसानी से प्रजनन योग्य, न्यूनतम आक्रामक, स्थायी स्ट्रोक मॉडल प्रदर्शित करते हैं और स्ट्रोक के पांच दिन बाद इनफाक्ट में बायोमटेरियल इंजेक्ट करने का वर्णन करते हैं। फोटोथ्रोम्बोटिक डाई रोज ब?…
The authors have nothing to disclose.
हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक फॉर फंडिंग (R01NS079691) को स्वीकार करना पसंद करते हैं ।
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |