Iniezione di scaffold di idrogel Biomateriale al cervello dopo l'ictus

Summary

L’ictus è un problema globale con opzioni di trattamento minime e nessuna terapia clinica attuale per rigenerare il tessuto cerebrale perso. Qui descriviamo i metodi per creare un preciso colpo fototrombotico nella corteccia motoria dei roditori e la successiva iniezione di biomateriali idrogel per studiare i loro effetti sulla rigenerazione dei tessuti dopo l’ictus.

Abstract

L’ictus è la principale causa di disabilità e la quinta causa di morte negli Stati Uniti. Circa l’87% di tutti gli ictus sono ictus ischemici e sono definiti come il blocco improvviso di un vaso che fornisce sangue al cervello. Entro pochi minuti dal blocco, le cellule iniziano a morire e provocano danni irreparabili ai tessuti. Gli attuali trattamenti terapeutici si concentrano sulla rimozione del coagulo o sulla lisi per consentire la riperfusione e prevenire danni cerebrali più gravi. Sebbene la plasticità cerebrale transitoria possa salvare parte del tessuto danneggiato nel tempo, frazioni significative di pazienti rimangono con deficit neurologici che non si risolveranno mai. C’è una mancanza di opzioni terapeutiche per trattare i deficit neurologici causati dall’ictus, sottolineando la necessità di sviluppare nuove strategie per trattare questa crescente popolazione di pazienti. I biomateriali iniettabili sono attualmente in fase di progettazione per migliorare la plasticità cerebrale e migliorare la riparazione endogena attraverso la somministrazione di agenti attivi o cellule staminali. Un metodo per testare questi approcci è quello di utilizzare un modello di colpo di roditore, iniettare il biomateriale nel nucleo dell’ictus e valutare la riparazione. Conoscere la posizione precisa del nucleo dell’ictus è fondamentale per il trattamento accurato dopo l’ictus, pertanto, un modello di ictus che si traduce in una posizione di ictus prevedibile è preferibile per evitare la necessità di imaging prima dell’iniezione. Il seguente protocollo tratterà come indurre un ictus fototrombotico, come iniettare un idrogel in modo controllato e preciso e come estrarre e criosezionare il cervello mantenendo intatto il biomateriale. Inoltre, evidenzieremo come questi stessi materiali idrogel possono essere utilizzati per la co-consegna di cellule staminali. Questo protocollo può essere generalizzato all’uso di altri biomateriali iniettabili nel nucleo dell’ictus.

Introduction

L’ictus è la principale causa di disabilità e la quinta causa di morte negli Stati Uniti¹. Circa l’87% di tutti gli ictus sono ischemici, mentre la maggior parte del restante 13% sono emorragici². Un ictus ischemico è definito come il blocco del flusso sanguigno in un’arteria al tessuto circostante. Questa occlusione si traduce in privazione di ossigeno e successiva necrosi che spesso porta a disabilità permanente nei pazienti sopravvissuti. Mentre c’è stata una diminuzione del tasso di mortalità^{dell’ictus 3}, la sua prevalenza dovrebbe aumentare a 3,4 milioni di persone entro il 2030⁴. Questo aumento dei sopravvissuti disabili e il conseguente onere economico ha portato a una spinta per la ricerca sull’ictus che si concentra sui meccanismi di riparazione neurale. Dopo l’ictus c’è un periodo infiammatorio che porta alla formazione di una cicatrice che impedisce alla regione necrotica di espandersi. La regione che circonda il nucleo necrotico è definita “peri-infarto” e vi è una forte evidenza che la plasticità in questa regione, che include l’aumento dell’angiogenesi, della neurogenesi e della germinazione assonale, è direttamente collegata al recupero osservato nei modelli animali e umani⁵. Poiché non esistono modelli in vitro in grado di replicare correttamente le complesse interazioni successive all’ictus, i modelli animali sono essenziali per la ricerca sull’ictus.

Esistono diversi modelli in vivo che possono essere utilizzati per produrre ictus ischemico. Uno dei modelli più comuni utilizzati nei topi è l’occlusione dell’arteria cerebrale media, o MCAo, attraverso l’occlusione distale o prossimale (tramite filamento intra-arterioso). Il modello prossimale, noto anche come filamento MCAo (fMCAo), in genere si traduce in grandi ictus ischemici che comprendono ovunque dal 5% al 50% dell’emisfero cerebrale, a seconda del numero di fattori⁶. In questi modelli, una sutura o un filamento viene avanzato dall’arteria carotide interna alla base dell’arteria cerebrale media (MCA) e mantenuto in posizione per un determinato periodo di tempo. Questo metodo per l’occlusione, che può essere reso temporaneo o permanente, produce un infarto centrato nello striato e può o meno coinvolgere la corteccia sovrastante⁶. La dimensione del tratto risultante è altamente variabile e sono necessarie tecniche di imaging, come il doppler laser, per confermare l’efficacia della procedura in ciascun topo. L’occlusione del filamento intra-arterioso o intra-luminale che dura più di 30 minuti produce ictus all’estremità più ampia dell’intervallo di dimensioni. Alcuni ricercatori si sono concentrati su tempi di occlusione del filamento più brevi, che richiedono una sostanziale attenzione sperimentale e la convalida del laboratorio⁷. I modelli di filamento MCAo nei topi seguono fasi simili di morte cellulare, progressione ischemica e formazione di una regione peri-infartuale come osservato nei casi di ictus umano; tuttavia, gli ictus più grandi assomigliano più da vicino allo stato di malattia degli infarti cerebrali maligni, che sono meno comuni, meno curabili ictus umani⁶. Nel frattempo, l’occlusione MCA distale richiede un intervento chirurgico e una craniectomia più coinvolti. In questo modello, la parte distale dell’MCA che corre lungo la superficie del cervello è direttamente occlusa con una cravatta di sutura o cauterizzazione. In alcune varianti della tecnica, le arterie carotidi sono unilateralmente occluse unilateralmente o transitoriamente-bilateralmente. Un vantaggio dell’MCAo distale è che produce una corsa a base corticale di dimensioni inferiori rispetto al modello di filamento. Tuttavia, il modello distale produce un output comportamentale più povero a causa della traselezione dell’arteria carotide esterna (ECA), che è anche una preoccupazione con fMCAo⁶.

Un modello di corsa alternativo che è noto per essere meno invasivo è il modello fototrombotico (PT). Il modello PT si traduce in una posizione ben definita di ischemia ed è associato ad un alto tasso di sopravvivenza⁸. La tecnica si basa su un colorante fotosensibile iniettato per via intraperitoneale che consente la foto-ossidazione intravascolare semplicemente irradiando il tessuto desiderato con una luce o un laser⁹. Dopo l’eccitazione, si formano radicali di ossigeno che causano danni endoteliali, che attivano l’aggregazione piastrinica e la formazione di coaguli nell’area irradiata^8,9. Lo stretto controllo sulla dimensione e la posizione della corsa, nonché l’elevata riproducibilità del modello PT, lo rendono ideale per lo studio dei biomateriali. Mentre la precisione è resa possibile utilizzando un laser e coordinate stereotassiche, ci sono alcuni svantaggi che possono rendere questo modello meno ideale per pochi studi. A differenza del modello fMCAo, il modello di corsa PT non può essere riperfuso. Pertanto, i materiali per studiare gli agenti neuroprotettivi specifici per i danni a seguito di riperfusione o i meccanismi successivi alla riperfusione non sarebbero utili qui⁸. Inoltre, a causa dell’insulto microvascolare del modello PT, si vede una penombra ischemica relativamente piccola. Invece, si verifica edema vasogenico locale, che è insolito per l’ictus umano, rendendo questo modello indesiderabile per gli studi farmacologici preclinici focalizzati sull’area peri-infartuale^6,8.

L’obiettivo generale delle strategie dei biomateriali nell’ictus è quello di fornire agenti bioattivi o di agire come una matrice extracellulare surrogata per la crescita del tessuto cerebrale. Una strategia che esploreremo utilizzando i nostri metodi è quella di fornire idrogel direttamente nel nucleo dell’ictus, al contrario del tessuto peri-infartuale in cui vengono somministrate molte terapie cellulari attuali¹⁰. Il razionale di questo approccio è che la consegna nel tessuto necrotico trovato nel nucleo eviterà di interrompere il tessuto sano circostante o di recuperare. Supponiamo che la diffusione di qualsiasi agente attivo incluso nel biomateriale sarà in grado di raggiungere il peri-infarto dal nucleo, soprattutto perché troviamo che la consegna di biomateriali idrogel riduce lo spessore della cicatrice gliale¹¹. Questo è importante poiché la regione del peri-infarto ha dimostrato di mostrare neuroplasticità dopo l’ictus, rendendola un bersaglio attraente. Inoltre, la consegna di una matrice surrogata al nucleo dell’ictus può essere caricata con¹² angiogenici o¹³ fattori neurogeni per guidare la formazione di nuovo tessuto, così come le cellule per la consegna¹⁴. La consegna cellulare è notevolmente migliorata utilizzando una matrice perché protegge le cellule dalle dure forze di iniezione e dall’ambiente locale presente durante il parto, oltre a incoraggiare la differenziazione e l’attecchimento¹⁵.

Questi biomateriali terapeutici iniettabili hanno rilevanza clinica nelle applicazioni dell’ictus, in quanto attualmente non esistono terapie mediche che stimolino il recupero neuronale dopo l’ictus. I circuiti neurali sottostanti coinvolti nel recupero si trovano nel tessuto cerebrale adiacente al nucleo^{dell’ictus 16}, mentre il nucleo dell’ictus stesso è privo di tessuto neurale vitale. Prevediamo che la consegna di un biomateriale nel nucleo dell’ictus necrotico ha il potenziale per stimolare il tessuto adiacente verso processi rigenerativi attraverso una serie di meccanismi precedentemente menzionati, tra cui il rilascio di depositi di fattori di^{crescita 13,}la stimolazione della crescita del tessuto e la promozione del recupero^dellosviluppo del tessuto cerebrale^{11, 12,}l’alterazione delle risposte immunitarie¹⁷e la consegna di terapie derivate da cellule staminali^{14, 18}. Tuttavia, per studiare efficacemente la possibilità di queste applicazioni, è necessario un metodo coerente e riproducibile per indurre l’ictus e iniettare biomateriali. Il modello di corsa PT utilizza tecniche che offrono un controllo preciso sull’orientamento e sulla posizione del tratto. Un laser collegato al dispositivo stereotassico guida gli orientamenti e le pompe collegate ai dispositivi stereotassica controllano la velocità di iniezione del materiale senza la necessità di ulteriori forme di imaging. Pertanto, abbiamo scelto di descrivere i metodi per eseguire un colpo PT nelle cortecce motorie dei topi e per iniettare biomateriali nel nucleo dell’ictus. Qui, utilizziamo idrogel di particelle ricotte microporose (MAP) come biomateriale per iniezione senza cellule aggiunte o fattori di crescita. Inoltre, spieghiamo come recuperare con successo il cervello con biomateriale intatto e discutiamo i saggi di immunochimica utilizzati per analizzare l’esito dell’ictus con e senza iniezione di biomateriali.

Protocol

Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con IUCAC presso la Duke University e l’Università della California di Los Angeles. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 8 e 12 settimane. Gli animali sono stati alloggiati a temperatura controllata (22 ± 2 °C), con un ciclo luce-buio di 12 ore e accesso a cibo e acqua pellettati ad libitum. I protocolli di analgesia e sedazione sono descritti come approvati dall’IUCAC, ma potrebbero differire dai protocolli utilizzati in al…

Representative Results

Lo scopo di questo metodo era dimostrare come iniettare biomateriali nel cervello dopo l’ictus. Un modello fototrombotico con rose bengal e un laser a 520 nm è stato utilizzato per l’orientamento controllato della lesione del tratto sia in termini di dimensioni che di posizione. Cinque giorni dopo l’ictus l’infarto poteva essere visualizzato durante l’intervento chirurgico (Figura 1B) e mediante TTC e imaging di vetrini macchiati IHC (Figura 2). Un aumento del …

Discussion

Qui dimostriamo un modello di ictus permanente facilmente riproducibile, minimamente invasivo e descriviamo come iniettare un biomateriale nell’infarto cinque giorni dopo l’ictus. L’uso del colorante fototrombotico Rose Bengal e di un laser collimato a 520 nm collegato al dispositivo stereotassico ci dà la possibilità di posizionare il tratto sulla corteccia motoria del mouse con maggiore precisione. Cinque giorni dopo l’ictus, la posizione dell’infarto è visibile a occhio al centro dell’irradiazione, 2,0 mm medio-lat…

Materials

10% Normal Goat Serum	VWR	100504-028	For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium	Medline	MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle	Fishcer Scientific	14824663	Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette	Gilson	M-25
2x Beam Expander, 400-650nm	Thorlabs	GBE02-A	Laser beam expander
Adjustable Stage Platform	Kopf Instruments	901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit	Abcam	ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat	abcam	ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12"	Medsupply	367294	For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil	Thorlabs	BKF12	To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2"	Sklar surgical instruments	64-2035
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664	8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter	Fine Science Tools	19007-05	For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate	VWR	EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers	Thorlabs	CLD1010LP
Cotton Swabs	VWR	89031-288
CP 25 pipette tips	Gilson	F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488)	abcam	ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647)	abcam	ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555)	abcam	ab150154
EMS DPX Mountant	Elecron Microscopy Sciences	13512	Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom	Electron Microscopy Sciences	16564	For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 45 PFA
ESD Worstation kit	Elmstat	WSKK5324SB	Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded	Thorlabs	HCA3	Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort	Thorlabs	PAF-X-5-A	FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm	Fine Science Tools	14028-10
GFAP Antibody, rat	Thermo Fisher Scientific	13-0300
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000	For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Iodine Prep Pads	Medx Supple	MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Laser Safety Glasses	Thorlabs	LG10B	Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck	United Scope	LED-11C
Medical USP Grade Oxygen	Airgas	OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade	Intefra Miltex	V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer	Harvard aparatus	72-6110
Mini-pump variable flow	Thomas Scientific	70730-064	Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm	Kent Scientific	RBMA-200c	For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Control Box	Chemyx	10050
Nanojet pump header	Chemxy	10051	Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch	Fishcer Scientific	NC9459562
Non-rupture ear bars 60º	Kopf Instruments	922
PBS buffer pH 7.4	VWR	97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin	Thorlabs	LP520-MF100
Positive charge glass slides	Hareta	AHS90-WH
Power engergy meter	Thorlabs	PM100D	Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rectal Probe Mouse	kopf Instruments	Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%	Sigma-Aldrich	330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth	Kopf Instruments	1770-02	For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor	Thorlabs	S130VC	Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining	Thorlabs	CP02	For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL	VWR	10002-726	To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	For staining slides
Sterotaxic device	Kopf Instruments	940	Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1×2 teeth	Fine Science Tools	91127-12
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks	Fine Science Tools	91113-10
Temperature Controller	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound	VWR	25608-930
Triton X-100	VWR	97063-864
Upper Bracket Clamp	Kopf Instruments	1770-c	For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931
Vogue Professional My Manicurist	Bargin Source	6400	For Burrs
VWR Bead Sterilizers	VWR	75999-328
Tissue Tek OCT compound	Sakura	4583	For tissue embeding