Summary

하이드로겔 생체 재료 비계의 주입 뇌졸중 후 뇌에

Published: October 01, 2020
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Summary

뇌졸중은 최소한의 치료 옵션과 잃어버린 뇌 조직을 재생하기위한 현재 임상 치료와 글로벌 문제입니다. 여기에서 우리는 설치류의 모터 피질에 정확한 광혈전 뇌졸중을 만들고 뇌졸중 후 조직 재생에 미치는 영향을 연구하기 위해 하이드로 겔 생체 재료의 후속 주입을 만드는 방법을 설명합니다.

Abstract

뇌졸중은 장애의 주요 원인과 미국에서 다섯 번째 주요 사망 원인입니다. 모든 뇌졸중의 약 87%는 허혈성 뇌졸중이며 뇌에 혈액을 공급하는 혈관의 갑작스런 막힘으로 정의됩니다. 막힘의 분 안에, 세포는 정지하기 시작하고 돌이킬 수 없는 조직 손상을 초래합니다. 현재 치료 치료는 혈전 제거 또는 용해에 초점을 맞추어 재관류를 허용하고 더 심각한 뇌 손상을 예방합니다. 일시적인 뇌 가소성은 시간이 지남에 따라 손상된 조직의 일부를 구출 할 수 있지만, 환자의 상당한 분수는 결코 해결되지 않을 신경 적자로 남아 있습니다. 뇌졸중으로 인한 신경 학적 적자를 치료하는 치료 옵션의 부족이있다, 이 증가하는 환자 인구를 치료하는 새로운 전략을 개발하는 필요성을 강조. 주사용 생체 재료는 현재 뇌 가소성을 향상시키고 활성 제또는 줄기 세포의 전달을 통해 내인성 수리를 개선하도록 설계되고 있습니다. 이러한 접근법을 테스트하는 한 가지 방법은 설치류 스트로크 모델을 활용하고, 생체 물질을 스트로크 코어에 주입하고, 수리를 평가하는 것입니다. 뇌졸중 코어의 정확한 위치를 아는 것은 뇌졸중 후 정확한 치료에 필수적이므로 예측 가능한 뇌졸중 위치를 초래하는 뇌졸중 모델은 주입 전에 이미징의 필요성을 피하는 것이 바람직하다. 다음 프로토콜은 광혈전 뇌졸중을 유도하는 방법, 제어되고 정확한 방식으로 하이드로겔을 주입하는 방법, 생물 물질을 손상시키면서 뇌를 추출하고 저온절하는 방법을 다룰 것입니다. 또한, 이러한 동일한 하이드로겔 물질이 줄기 세포의 공동 전달에 어떻게 사용될 수 있는지 강조할 것입니다. 이 프로토콜은 뇌졸중 코어내로 다른 주사용 생체 물질을 사용하는 것으로 일반화될 수 있다.

Introduction

뇌졸중은 장애의 주요 원인이며 미국에서 다섯 번째로 주요 사망원인입니다 1. 모든 뇌졸중의 약 87%는 허혈성이며 나머지 13%의 대다수는 출혈2입니다. 허혈성 뇌졸중은 주변 조직에 동맥에서 혈류의 막힘으로 정의됩니다. 이 폐색은 수시로 살아남는 환자에 있는 영원한 무력으로 이끌어 내는 산소 부족 그리고 후속 괴사 귀착됩니다. 뇌졸중3의사망률이 감소했지만, 2030년까지 보급은340만명으로 증가할 것으로 예상된다. 장애인 생존자의 증가와 그에 따른 경제적 부담은 신경 수리 메커니즘에 초점을 맞춘 뇌졸중 연구를 위한 추진으로 이어졌습니다. 뇌졸중 다음에 는 괴사 영역이 팽창하는 것을 방지하는 흉터의 형성으로 이어지는 염증 성 기간이 있습니다. 괴사 코어를 둘러싼 지역은 “peri-farct”라고 하며 혈관 신생, 신경 발생 및 축산 발아증가를 포함하는 이 지역의 가소성이 동물 모델과 인간5에서관찰된 회복에 직접 연결된다는 강력한 증거가 있다. 뇌졸중 후 복잡한 상호 작용을 적절하게 복제 할 수있는 체외 모델이 없기 때문에 동물 모델은 뇌졸중 연구에 필수적입니다.

허혈성 스트로크를 생성하는 데 사용할 수있는 생체 내 모델이 몇 가지 있습니다. 마우스에 사용되는 가장 일반적인 모델 중 하나는 말단 또는 근위 (동맥 내 필라멘트를 통해) 폐색을 통해 중간 뇌동맥 폐색, 또는 MCAo입니다. 필라멘트 MCAo (fMCAo)라고도 하는 근위 모델은 일반적으로 대뇌 반구의 5 %에서 50 %까지 포괄하는 큰 허혈성 뇌졸중을 초래하며 요인6의수에 의존합니다. 이러한 모델에서 봉합사 또는 필라멘트는 내부 경동맥에서 중간 뇌동맥(MCA)의 기저부로 발전하여 특정 기간 동안 제자리에 보관된다. 임시 또는 영구로 만들 수 있는 폐색을 위한 이 방법은, 줄무늬에 중심이 되는 광원을 생성하고, 피질6을지나치게 관련시킬 수도 있고 관련되지 않을 수도 있다. 결과 뇌졸중 크기는 매우 가변적이며 레이저 도플러와 같은 이미징 기술은 각 마우스에서 절차의 효과를 확인하는 데 필요합니다. 30분 이상 지속되는 동맥 내 또는 발내 필라멘트 폐색은 크기 범위의 더 큰 끝에서 스트로크를 생성합니다. 일부 조사관은 상당한 실험 초점과 실험실 검증7을필요로하는 짧은 필라멘트 폐색 시간에 초점을 맞추고있다. 마우스에 있는 필라멘트 MCAo 모형은 인간 적인 치기 케이스에서 보인 것과 같이 세포 죽음, 허혈성 진행 및 peri-farct 영역의 형성의 유사한 단계를 따릅니다; 그러나, 더 큰 치기는 악성 뇌 경색의 질병 상태를 더 가깝게 닮은, 덜 일반적이다, 덜 치료 인간 뇌졸중6. 한편, 말단 MCA 폐색은 더 관련된 수술및 craniectomy를 요구합니다. 이 모델에서, 뇌의 표면을 따라 실행되는 MCA의 말단 부분은 봉합사 넥타이 또는 소작으로 직접 가려져 있습니다. 기술의 일부 변형에서, 경동맥은 일방적또는 일시적으로 양측으로 가려져 있다. 말단 MCAo의 장점은 필라멘트 모델보다 크기가 덜 가변적인 피질 기반 스트로크를 생성한다는 것입니다. 그러나, 해단 모델은 fMCAo6의관심사인 외부 경동맥(ECA)의 질부로 인해 더 열악한 행동 출력을 생성한다.

덜 침습적 인 것으로 알려진 대체 뇌졸중 모델은 광혈전증 (PT) 모델입니다. PT 모델은 허혈의 잘 정의된 위치를 초래하고 높은 생존율8과연관된다. 이 기술은 빛 또는 레이저9로원하는 조직을 조사하기만 하면 인트라바스내 광 산화를 허용하는 인트라바스트(intraitone)에 주입된 감광성 염료에 의존한다. 자궁내막시, 내피 손상을 유발하는 산소 라디칼이 형성되어 조사부위8,9에서혈소판 응집 및 응고 형성을 활성화한다. 뇌졸중 크기와 위치를 엄격하게 제어할 뿐만 아니라 PT 모델의 높은 재현성은 생체 재료 연구에 이상적입니다. 정밀도는 레이저 및 스테레오탁스 좌표를 사용하여 가능하지만, 이 모델이 몇 가지 연구에 적합하지 않을 수 있다는 몇 가지 단점이 있습니다. fMCAo 모델과 달리 PT 스트로크 모델은 레퍼퍼프할 수 없습니다. 따라서, 재퍼퓨전 또는 레퍼퓨전 다음 메커니즘에 따른 손상에 특정한 신경보호제 조사를 위한 물질은 여기에서 유용하지 않을 것이다8. 또한 PT 모델의 미세 혈관 모욕으로 인해 상대적으로 작은 허혈성 음벌브라가 보입니다. 대신, 국소 혈관부종은 인간 뇌졸중에 특이하지 않은 것으로 발생하며, 이 모델은 peri-farct 영역6,8에초점을 맞춘 전임상 약물 연구에 바람직하지 않다.

뇌졸중의 생물 물질 전략의 전반적인 목표는 생리 활성 에이전트를 제공하거나 뇌 조직 성장을위한 대리 세포 외 매트릭스 역할을하는 것입니다. 우리가 우리의 방법을 사용하여 탐구할 한 가지 전략은 많은 현재 세포 치료가10전달되는peri-infarct 조직과 는 반대로, 스트로크 코어로 직접 하이드로겔을 전달하는 것입니다. 이 접근법에 대한 근거는 코어에서 발견되는 괴사 조직으로의 전달이 주변의 건강하거나 회복 조직을 방해하지 않을 것이라는 것입니다. 우리는 생물 물질 에 포함 된 임의의 활성 제의 확산은 코어에서 peri-farct에 도달 할 수있을 것입니다 가정, 우리는 하이드로 겔 생체 재료의 전달이 신경교 흉터(11)의두께를 감소 발견하기 때문에 특히. 이것은 peri-farct 지역이 치기 후에 신경 가소성을 전시하기 위하여 표시되었기 때문에 중요합니다, 매력적인 표적으로 만드는. 더욱이, 뇌졸중 코어에 대리 매트릭스의 전달은 새로운 조직의 형성을 유도하기 위해 혈관신생12 또는신경유발성 13인자를 로드할 수 있으며, 전달을 위한 세포(14). 세포 전달은 전달 중에 존재하는 가혹한 주입력 및 현지 환경으로부터 세포를 보호하고 분화 및이식(15)을장려하기 때문에 매트릭스를 사용하여 크게 향상된다.

이러한 주 사용 치료 생체 재료는 뇌졸중 응용 프로그램에서 임상 관련성이 있다, 현재 뇌졸중 후 신경 복구를 자극 하는 의료 치료. 복구에 관여하는 근본적인 신경 회로는 뇌졸중 코어16에인접한 뇌 조직에 있으며 뇌졸중 코어 자체는 실행 가능한 신경 조직이 없습니다. 괴사 뇌졸중 코어에 생체 물질을 전달하는 것은 이전에 언급 된 여러 메커니즘을 통해 인접 조직을 재생 프로세스로 자극 할 수있는 잠재력을 가지고 있을 것으로 예상됩니다( 성장 인자13의창고 방출, 조직 성장 의 자극 및 뇌 조직 개발의 촉진11,12,면역 반응의 변경 17, 줄기 세포 유래 치료제의 전달14, 18. 그러나 이러한 응용 프로그램의 가능성을 효과적으로 연구하기 위해서는 뇌졸중을 유도하고 생체 재료를 주입하는 일관되고 재현 가능한 방법이 필요합니다. PT 스트로크 모델은 스트로크의 방향과 위치를 정밀하게 제어하는 기술을 사용합니다. 스테레오탁틱 장치에 부착된 레이저는 방향을 안내하고, 스테레오택시 장치에 부착된 펌프는 추가 형태의 이미징 없이 재료의 사출 속도를 제어합니다. 따라서, 우리는 마우스의 모터 피질에서 PT 뇌졸중을 수행하고 뇌졸중 코어에 생체 물질을 주입하는 방법을 설명하기로 결정했습니다. 여기서, 우리는 추가된 세포 또는 성장 인자가 없는 주입을 위한 생물재료로 미세다공성 안구 입자(MAP) 하이드로겔을 사용합니다. 또한, 우리는 성공적으로 그대로 생물 재료로 뇌를 검색하는 방법을 설명하고, 우리는 생체 재료의 주입없이 뇌졸중 결과를 분석하는 데 사용되는 면역 화학 분석에 대해 논의.

Protocol

실험은 듀크 대학과 캘리포니아 로스 앤젤레스 대학의 IUCAC에 따라 수행되었다. 8 에서 12 주 된 남성 C57Bl/6J 마우스는이 연구에서 사용 되었다. 동물은 12h 빛-어두운 주기 기간과 펠릿 식품 및 물 광고 리비툼에 접근할 수 있는 제어 온도(22± 2°C)하에 보관되었습니다. 진통제 및 식기 프로토콜은 IUCAC에 의해 승인된 것으로 설명되지만 다른 실험실에서 사용되는 프로토콜과 다를 수 있습니다. <p cl…

Representative Results

이 방법의 목적은 뇌졸중 후 뇌에 생체 물질을 주입하는 방법을 시연하는 것이었습니다. 장미 벵골과 520 nm 레이저를 가진 광혈전 모델은 크기와 위치 모두에서 뇌졸중 병변의 제어 방향에 사용되었다. 뇌졸중 후 5일 동안 경색은수술(도 1B)및 TTC 및 이미징 IHC 염색 슬라이드(도2)에의해 시각화될 수 있다. 2x 렌즈를 가진 레이저 직경의 증가는 레이저만으…

Discussion

여기서 우리는 쉽게 재현 할 수있는, 최소 침습, 영구 뇌졸중 모델을 설명하고 뇌졸중 후 5 일 동안 광원에 생체 물질을 주입하는 방법을 설명합니다. 포토thrombotic 염료 로즈 벵골과 스테레오 탁스 장치에 연결된 520 nm 콜라주 레이저의 사용은 우리에게 향상된 정밀도로 마우스의 모터 피질에 스트로크를 배치 할 수있는 기능을 제공합니다. 뇌졸중 후 5일 후, 경색의 위치는 조사의 중심에 눈으로 볼…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 건강의 국가 학회 및 자금 조달을 위한 신경 장애 및 치기의 국가 학회 (R01NS079691)를 인정하고 싶습니다.

Materials

10% Normal Goat Serum VWR 100504-028 For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium Medline MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle Fishcer Scientific 14824663 Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette Gilson M-25
2x Beam Expander, 400-650nm Thorlabs GBE02-A Laser beam expander
Adjustable Stage Platform Kopf Instruments 901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit Abcam ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat abcam ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" Medsupply 367294 For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil Thorlabs BKF12 To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" Sklar surgical instruments 64-2035
C57BL/6 Mice Jackson Laboratory 000664 8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob Thorlabs ER3-P4 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter Fine Science Tools 19007-05 For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate VWR EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers Thorlabs CLD1010LP
Cotton Swabs VWR 89031-288
CP 25 pipette tips Gilson F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488) abcam ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) abcam ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) abcam ab150154
EMS DPX Mountant Elecron Microscopy Sciences 13512 Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom Electron Microscopy Sciences 16564 For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 45 PFA
ESD Worstation kit Elmstat WSKK5324SB Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded Thorlabs HCA3 Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort Thorlabs PAF-X-5-A FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm Fine Science Tools 14028-10
GFAP Antibody, rat Thermo Fisher Scientific 13-0300
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000 For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center VetEquip 901808
Iodine Prep Pads Medx Supple MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5 GFS chemicals 46085
Laser Safety Glasses Thorlabs LG10B Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck United Scope LED-11C
Medical USP Grade Oxygen Airgas OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade Intefra Miltex V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer Harvard aparatus 72-6110
Mini-pump variable flow Thomas Scientific 70730-064 Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm Kent Scientific RBMA-200c For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder Kopf Instruments 923-B
Nanojet Control Box Chemyx 10050
Nanojet pump header Chemxy 10051 Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch Fishcer Scientific NC9459562
Non-rupture ear bars 60º Kopf Instruments 922
PBS buffer pH 7.4 VWR 97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin Thorlabs LP520-MF100
Positive charge glass slides Hareta AHS90-WH
Power engergy meter Thorlabs PM100D Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment Dr. Foster Smith 9N-76855
Rectal Probe Mouse kopf Instruments Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95% Sigma-Aldrich 330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth Kopf Instruments 1770-02 For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor Thorlabs S130VC Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining Thorlabs CP02 For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL VWR 10002-726 To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System Simport Scientific M920-2 For staining slides
Sterotaxic device Kopf Instruments 940 Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1×2 teeth Fine Science Tools 91127-12
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks Fine Science Tools 91113-10
Temperature Controller Kopf Instruments TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound VWR 25608-930
Triton X-100 VWR 97063-864
Upper Bracket Clamp Kopf Instruments 1770-c For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL Santa Cruz Biotechnology sc-361931
Vogue Professional My Manicurist Bargin Source 6400 For Burrs
VWR Bead Sterilizers VWR 75999-328
Tissue Tek OCT compound Sakura 4583 For tissue embeding

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check_url/fr/61450?article_type=t

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Citer Cet Article
Wilson, K. L., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke. J. Vis. Exp. (164), e61450, doi:10.3791/61450 (2020).

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