Summary

Injektion av Hydrogel Biomaterial byggnadsställningar till hjärnan efter stroke

Published: October 01, 2020
doi:

Summary

Stroke är ett globalt problem med minimala behandlingsalternativ och ingen aktuell klinisk terapi för regenererande den förlorade hjärnvävnaden. Här beskriver vi metoder för att skapa exakta fototrobotiska stroke i motor cortex av gnagare och efterföljande injektion av hydrogel biomaterial för att studera deras effekter på vävnad regenerering efter stroke.

Abstract

Stroke är den främsta orsaken till funktionshinder och den femte vanligaste dödsorsaken i USA. Ungefär 87% av alla stroke är ischemiska stroke och definieras som den plötsliga blockeringen av ett kärl som levererar blod till hjärnan. Inom några minuter efter blockeringen börjar celler dö och resulterar i irreparabla vävnadsskador. Nuvarande terapeutiska behandlingar fokuserar på blodproppsborttagning eller lys för att möjliggöra reperfusion och förhindra allvarligare hjärnskador. Även om övergående hjärnan plasticitet kan rädda en del av den skadade vävnaden över tid, betydande fraktioner av patienter lämnas med neurologiska underskott som aldrig kommer att lösa. Det saknas terapeutiska alternativ för att behandla neurologiska underskott orsakade av stroke, betonar behovet av att utveckla nya strategier för att behandla denna växande patientpopulation. Injicerbara biomaterial är för närvarande utformade för att förbättra hjärnans plasticitet och förbättra endogen reparation genom leverans av aktiva medel eller stamceller. En metod för att testa dessa metoder är att använda en gnagare stroke modell, injicera biomaterialet i strokekärnan och bedöma reparation. Att veta den exakta platsen för strokekärnan är absolut nödvändigt för korrekt behandling efter stroke, därför är en strokemodell som resulterar i en förutsägbar strokeplats att föredra för att undvika behovet av avbildning före injektion. Följande protokoll kommer att täcka hur man inducerar en fototrobotisk stroke, hur man injicerar en hydrogel på ett kontrollerat och exakt sätt och hur man extraherar och kryoserar hjärnan samtidigt som biomaterialet hålls intakt. Dessutom kommer vi att belysa hur samma hydrogelmaterial kan användas för samleverans av stamceller. Detta protokoll kan generaliseras till användning av andra injicerbara biomaterial i slagkärnan.

Introduction

Stroke är den främsta orsaken till funktionshinder och den femte ledande dödsorsaken i USA1. Cirka 87% av alla stroke är ischemiska, medan en majoritet av de återstående 13% är hemorragiska2. En ischemisk stroke definieras som blockering av blodflödet i en artär till den omgivande vävnaden. Denna ocklusion resulterar i syrebrist och efterföljande nekros som ofta leder till permanent funktionshinder hos överlevande patienter. Även om dödligheten i stroke3har minskat, förväntas prevalensen öka till 3,4 miljoner människor år 20304. Denna ökning av funktionshindrade överlevande och därav följande ekonomiska börda har lett till en push för strokeforskning som fokuserar på mekanismer för neural reparation. Efter stroke finns en inflammatorisk period som leder till bildandet av ett ärr som förhindrar att den nekrotiska regionen expanderar. Regionen kring den nekrotiska kärnan kallas “peri-infarct” och det finns starka bevis för att plasticiteten i denna region, som inkluderar ökad angiogenes, neurogenes och axonal groddning, är direkt kopplad till den observerade återhämtningen hos djurmodeller och människor5. Eftersom det inte finns några in vitro-modeller som korrekt kan replikera de komplexa interaktionerna efter stroke, är djurmodeller viktiga för strokeforskning.

Det finns flera in vivo-modeller som kan användas för att producera ischemisk stroke. En av de vanligaste modellerna som används hos möss är mellersta cerebrala gatan ocklusion, eller MCAo, genom distala eller proximal (via intraartär filament) ocklusion. Den proximala modellen, även känd som filament MCAo (fMCAo), resulterar vanligtvis i stora ischemiska slag som omfattar allt från 5% till 50% av hjärnhalvan, beroende på antalet faktorer6. I dessa modeller förs en sutur eller glödtråd fram från den inre halsartären till basen av den mellersta cerebrala artären (MCA) och hålls på plats under en viss tidsperiod. Denna metod för ocklusion, som kan göras tillfällig eller permanent, producerar en infarkt som är centrerad i striatum och kan eller inte kan innebära övergående cortex6. Den resulterande slagstorleken är mycket varierande, och avbildningstekniker, såsom laserdoppler, krävs för att bekräfta effektiviteten av proceduren i varje mus. Intraartär eller intra-luminal filamentocklusion som varar mer än 30 minuter producerar slag i den större änden av storleksområdet. Vissa utredare har fokuserat på kortare ocklusionstider för filament, vilket kräver betydande experimentellt fokus och labbvalidering7. Filament MCAo modeller i möss följer liknande stadier av celldöd, skandinavisk progression och bildandet av en peri-infarct region som ses i mänskliga stroke fall; de större stroke liknar dock sjukdomstillståndet hos maligna cerebrala hjärtinfarkter, som är mindre vanliga, mindre behandlingsbara mänskliga stroke6. Under tiden kräver distala MCA ocklusion en mer involverad kirurgi och craniectomy. I denna modell är den distala delen av MCA som löper längs hjärnans yta direkt ockluserad med en sutur slips eller cauterization. I vissa variationer av tekniken är halsartären ensidigt eller övergående-bilateralt ockluderade. En fördel med distala MCAo är att det producerar en närbaserad stroke som är mindre variabel i storlek än filamentmodellen. Den distala modellen producerar dock sämre beteendeutgång på grund av omsektion av den yttre halsartären (ECA), vilket också är ett problem med fMCAo6.

En alternativ strokemodell som är känd för att vara mindre invasiv är den fototrobotiska (PT) modellen. PT-modellen resulterar i en väldefinierad plats för ischemi och är förknippad med en hög överlevnadsgrad8. Tekniken förlitar sig på ett ljuskänsligt färgämne injicerat intraperitoneally som möjliggör intravaskulär fotooxidation helt enkelt genom att bestråla önskad vävnad med ett ljus eller laser9. Vid excitation bildas syreradikaler som orsakar endotelskada, vilket aktiverar trombocytaggregering och koagelbildning i det bestrålade området8,9. Den snäva kontrollen över slagstorlek och placering, liksom pt-modellens höga reproducerbarhet, gör den idealisk för att studera biomaterial. Medan precision möjliggörs med hjälp av en laser och stereotaxiska koordinater, finns det några nackdelar som kan göra denna modell mindre idealisk för få studier. Till skillnad från fMCAo-modellen kan PT-linjemodellen inte reperfuseeras. Därför skulle material för att undersöka neuroprotektiva medel som är specifika för skador efter reperfusion eller mekanismerna efter reperfusion inte vara användbara här8. Dessutom, på grund av den mikrovaskulära förolämpningen av PT-modellen, ses relativt liten ischemisk penumbra. Istället uppstår lokalt vasogent ödem, vilket är okarakteristiskt för mänsklig stroke, vilket gör denna modell oönskad för prekliniska läkemedelsstudier fokuserade på peri-infarktområdet6,8.

Det övergripande målet med biomaterialstrategier i stroke är att antingen leverera bioaktiva medel eller att fungera som en surrogat extracellulär matris för hjärnvävnadstillväxt. En strategi som vi kommer att utforska med våra metoder är att leverera hydrogel direkt in i strokekärnan, i motsats till peri-infarktvävnaden där många nuvarande cellterapier levereras10. Grunden för detta tillvägagångssätt är att leverans till den nekrotiska vävnaden som finns i kärnan kommer att undvika att störa den omgivande friska eller återhämtande vävnaden. Vi antar att diffusion av alla aktiva medel som ingår i biomaterialet kommer att kunna nå peri-infarct från kärnan, särskilt eftersom vi finner att leverans av hydrogelbiomaterial minskar tjockleken på gliaärret11. Detta är viktigt eftersom regionen peri-infarct har visat sig uppvisa neuroplasticitet efter stroke, vilket gör det till ett attraktivt mål. Dessutom kan leveransen av en surrogatmatris till slagkärnan laddas med angiogena12 eller neurogena13 faktorer för att styra bildandet av ny vävnad, liksom celler för leveransen14. Celltillförseln förbättras avsevärt genom att använda en matris eftersom den skyddar cellerna från de hårda injektionskrafterna och den lokala miljön som finns under leveransen, samt uppmuntrar differentiering och inympning15.

Dessa injicerbara terapeutiska biomaterial har klinisk relevans i stroke applikationer, eftersom det för närvarande inte finns några medicinska terapier som stimulerar neuronal återhämtning efter stroke. De underliggande neurala kretsarna som är involverade i återhämtning ligger i hjärnvävnad som ligger intill strokekärnan16, medan strokekärnan själv saknar livskraftig neural vävnad. Vi förväntar oss att leverans av ett biomaterial i den nekrotiska strokekärnan har potential att stimulera den intilliggande vävnaden mot regenerativa processer genom ett antal mekanismer som tidigare nämnts, inklusive depåutgivning av tillväxtfaktorer13,stimulering av vävnadstillväxt och främjande av återhämtning av hjärnvävnadsutveckling11,12,förändring av immunsvar17och leverans av stamcellsbaserade terapier14, 18. För att effektivt studera möjligheten till dessa tillämpningar behövs dock en konsekvent och reproducerbar metod för att inducera stroke och injicera biomaterial. PT-linjemodellen använder tekniker som ger exakt kontroll över orienteringen och platsen för slaget. En laser som är fäst vid den stereotaxiska enheten styr orienteringar, och pumpar som är anslutna till de stereotaxiska enheterna styr insprutningshastigheten för materialet utan att behöva ytterligare former av avbildning. Därför har vi valt att beskriva metoderna för att utföra en PT-stroke i mössens motoriska cortexer och för att injicera biomaterial i strokekärnan. Här använder vi mikroporösa glödgade partiklar (MAP) hydrogeler som biomaterial för injektion utan tillsatta celler eller tillväxtfaktorer. Dessutom förklarar vi hur man framgångsrikt hämtar hjärnan med intakt biomaterial, och vi diskuterar immunokemiska analyser som används för att analysera stroke resultatet med och utan injektion av biomaterial.

Protocol

Experimenten utfördes i enlighet med IUCAC vid Duke University och University of California Los Angeles. 8 till 12 veckor gamla manliga C57Bl/6J möss användes i denna studie. Djuren hölls under kontrollerad temperatur (22 ± 2 °C), med en ljusmörk cykelperiod på 12 timmar och tillgång till pelleterad mat och vatten ad libitum. Analgesi- och sederingsprotokoll beskrivs som godkända av IUCAC men kan skilja sig från protokoll som används i andra laboratorier. Djur kan avlivas i förtid…

Representative Results

Syftet med denna metod var att visa hur man injicerar biomaterial i hjärnan efter stroke. En fotothrombotic modell med rose bengal och en 520 nm laser användes för kontrollerad orientering av stroke lesion i både storlek och plats. Fem dagar efter stroke kunde infarkten visualiseras under operationen(figur 1B) och av TTC och bildbehandling IHC färgade diabilder (figur 2). En ökning av laserdiametern med en 2x lins leder till en visuell ökning av strokeska…

Discussion

Här visar vi en lätt reproducerbar, minimalt invasiv, permanent stroke modell och beskriver hur man injicerar ett biomaterial i infarct fem dagar efter stroke. Användningen av det fototrobotiska färgämnet Rose Bengal och en 520 nm kollimerad laser ansluten till den stereotaxiska enheten ger oss möjlighet att placera slaget vid musens motorbark med förbättrad precision. Fem dagar efter stroke är infarktens placering synlig med ögat i centrum av bestrålning, 2,0 mm medio-lateral till bregma. Hydrogel injiceras s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill uppmärksamma National Institutes of Health och National Institute of Neurological Disorders and Stroke för finansiering (R01NS079691).

Materials

10% Normal Goat Serum VWR 100504-028 For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium Medline MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle Fishcer Scientific 14824663 Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette Gilson M-25
2x Beam Expander, 400-650nm Thorlabs GBE02-A Laser beam expander
Adjustable Stage Platform Kopf Instruments 901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit Abcam ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat abcam ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" Medsupply 367294 For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil Thorlabs BKF12 To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" Sklar surgical instruments 64-2035
C57BL/6 Mice Jackson Laboratory 000664 8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob Thorlabs ER3-P4 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter Fine Science Tools 19007-05 For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate VWR EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers Thorlabs CLD1010LP
Cotton Swabs VWR 89031-288
CP 25 pipette tips Gilson F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488) abcam ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) abcam ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) abcam ab150154
EMS DPX Mountant Elecron Microscopy Sciences 13512 Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom Electron Microscopy Sciences 16564 For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 45 PFA
ESD Worstation kit Elmstat WSKK5324SB Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded Thorlabs HCA3 Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort Thorlabs PAF-X-5-A FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm Fine Science Tools 14028-10
GFAP Antibody, rat Thermo Fisher Scientific 13-0300
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories H-4000 For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center VetEquip 901808
Iodine Prep Pads Medx Supple MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5 GFS chemicals 46085
Laser Safety Glasses Thorlabs LG10B Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck United Scope LED-11C
Medical USP Grade Oxygen Airgas OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade Intefra Miltex V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer Harvard aparatus 72-6110
Mini-pump variable flow Thomas Scientific 70730-064 Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm Kent Scientific RBMA-200c For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder Kopf Instruments 923-B
Nanojet Control Box Chemyx 10050
Nanojet pump header Chemxy 10051 Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch Fishcer Scientific NC9459562
Non-rupture ear bars 60º Kopf Instruments 922
PBS buffer pH 7.4 VWR 97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin Thorlabs LP520-MF100
Positive charge glass slides Hareta AHS90-WH
Power engergy meter Thorlabs PM100D Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment Dr. Foster Smith 9N-76855
Rectal Probe Mouse kopf Instruments Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95% Sigma-Aldrich 330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth Kopf Instruments 1770-02 For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor Thorlabs S130VC Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining Thorlabs CP02 For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL VWR 10002-726 To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System Simport Scientific M920-2 For staining slides
Sterotaxic device Kopf Instruments 940 Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1×2 teeth Fine Science Tools 91127-12
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks Fine Science Tools 91113-10
Temperature Controller Kopf Instruments TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound VWR 25608-930
Triton X-100 VWR 97063-864
Upper Bracket Clamp Kopf Instruments 1770-c For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL Santa Cruz Biotechnology sc-361931
Vogue Professional My Manicurist Bargin Source 6400 For Burrs
VWR Bead Sterilizers VWR 75999-328
Tissue Tek OCT compound Sakura 4583 For tissue embeding

References

  1. National Center for Health Statistics. . Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
  3. Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
  4. Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
  5. Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
  6. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
  7. Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
  8. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  9. Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
  10. Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
  11. Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
  12. Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
  13. Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
  14. Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
  15. Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
  16. Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
  17. Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
  18. Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
  19. Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
  20. Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
  21. Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
  22. Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
  23. Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
  24. Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
  25. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
  26. Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
  27. Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
  28. Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
  29. Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
  30. Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
  31. Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
check_url/fr/61450?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Wilson, K. L., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke. J. Vis. Exp. (164), e61450, doi:10.3791/61450 (2020).

View Video