Stroke är ett globalt problem med minimala behandlingsalternativ och ingen aktuell klinisk terapi för regenererande den förlorade hjärnvävnaden. Här beskriver vi metoder för att skapa exakta fototrobotiska stroke i motor cortex av gnagare och efterföljande injektion av hydrogel biomaterial för att studera deras effekter på vävnad regenerering efter stroke.
Stroke är den främsta orsaken till funktionshinder och den femte vanligaste dödsorsaken i USA. Ungefär 87% av alla stroke är ischemiska stroke och definieras som den plötsliga blockeringen av ett kärl som levererar blod till hjärnan. Inom några minuter efter blockeringen börjar celler dö och resulterar i irreparabla vävnadsskador. Nuvarande terapeutiska behandlingar fokuserar på blodproppsborttagning eller lys för att möjliggöra reperfusion och förhindra allvarligare hjärnskador. Även om övergående hjärnan plasticitet kan rädda en del av den skadade vävnaden över tid, betydande fraktioner av patienter lämnas med neurologiska underskott som aldrig kommer att lösa. Det saknas terapeutiska alternativ för att behandla neurologiska underskott orsakade av stroke, betonar behovet av att utveckla nya strategier för att behandla denna växande patientpopulation. Injicerbara biomaterial är för närvarande utformade för att förbättra hjärnans plasticitet och förbättra endogen reparation genom leverans av aktiva medel eller stamceller. En metod för att testa dessa metoder är att använda en gnagare stroke modell, injicera biomaterialet i strokekärnan och bedöma reparation. Att veta den exakta platsen för strokekärnan är absolut nödvändigt för korrekt behandling efter stroke, därför är en strokemodell som resulterar i en förutsägbar strokeplats att föredra för att undvika behovet av avbildning före injektion. Följande protokoll kommer att täcka hur man inducerar en fototrobotisk stroke, hur man injicerar en hydrogel på ett kontrollerat och exakt sätt och hur man extraherar och kryoserar hjärnan samtidigt som biomaterialet hålls intakt. Dessutom kommer vi att belysa hur samma hydrogelmaterial kan användas för samleverans av stamceller. Detta protokoll kan generaliseras till användning av andra injicerbara biomaterial i slagkärnan.
Stroke är den främsta orsaken till funktionshinder och den femte ledande dödsorsaken i USA1. Cirka 87% av alla stroke är ischemiska, medan en majoritet av de återstående 13% är hemorragiska2. En ischemisk stroke definieras som blockering av blodflödet i en artär till den omgivande vävnaden. Denna ocklusion resulterar i syrebrist och efterföljande nekros som ofta leder till permanent funktionshinder hos överlevande patienter. Även om dödligheten i stroke3har minskat, förväntas prevalensen öka till 3,4 miljoner människor år 20304. Denna ökning av funktionshindrade överlevande och därav följande ekonomiska börda har lett till en push för strokeforskning som fokuserar på mekanismer för neural reparation. Efter stroke finns en inflammatorisk period som leder till bildandet av ett ärr som förhindrar att den nekrotiska regionen expanderar. Regionen kring den nekrotiska kärnan kallas “peri-infarct” och det finns starka bevis för att plasticiteten i denna region, som inkluderar ökad angiogenes, neurogenes och axonal groddning, är direkt kopplad till den observerade återhämtningen hos djurmodeller och människor5. Eftersom det inte finns några in vitro-modeller som korrekt kan replikera de komplexa interaktionerna efter stroke, är djurmodeller viktiga för strokeforskning.
Det finns flera in vivo-modeller som kan användas för att producera ischemisk stroke. En av de vanligaste modellerna som används hos möss är mellersta cerebrala gatan ocklusion, eller MCAo, genom distala eller proximal (via intraartär filament) ocklusion. Den proximala modellen, även känd som filament MCAo (fMCAo), resulterar vanligtvis i stora ischemiska slag som omfattar allt från 5% till 50% av hjärnhalvan, beroende på antalet faktorer6. I dessa modeller förs en sutur eller glödtråd fram från den inre halsartären till basen av den mellersta cerebrala artären (MCA) och hålls på plats under en viss tidsperiod. Denna metod för ocklusion, som kan göras tillfällig eller permanent, producerar en infarkt som är centrerad i striatum och kan eller inte kan innebära övergående cortex6. Den resulterande slagstorleken är mycket varierande, och avbildningstekniker, såsom laserdoppler, krävs för att bekräfta effektiviteten av proceduren i varje mus. Intraartär eller intra-luminal filamentocklusion som varar mer än 30 minuter producerar slag i den större änden av storleksområdet. Vissa utredare har fokuserat på kortare ocklusionstider för filament, vilket kräver betydande experimentellt fokus och labbvalidering7. Filament MCAo modeller i möss följer liknande stadier av celldöd, skandinavisk progression och bildandet av en peri-infarct region som ses i mänskliga stroke fall; de större stroke liknar dock sjukdomstillståndet hos maligna cerebrala hjärtinfarkter, som är mindre vanliga, mindre behandlingsbara mänskliga stroke6. Under tiden kräver distala MCA ocklusion en mer involverad kirurgi och craniectomy. I denna modell är den distala delen av MCA som löper längs hjärnans yta direkt ockluserad med en sutur slips eller cauterization. I vissa variationer av tekniken är halsartären ensidigt eller övergående-bilateralt ockluderade. En fördel med distala MCAo är att det producerar en närbaserad stroke som är mindre variabel i storlek än filamentmodellen. Den distala modellen producerar dock sämre beteendeutgång på grund av omsektion av den yttre halsartären (ECA), vilket också är ett problem med fMCAo6.
En alternativ strokemodell som är känd för att vara mindre invasiv är den fototrobotiska (PT) modellen. PT-modellen resulterar i en väldefinierad plats för ischemi och är förknippad med en hög överlevnadsgrad8. Tekniken förlitar sig på ett ljuskänsligt färgämne injicerat intraperitoneally som möjliggör intravaskulär fotooxidation helt enkelt genom att bestråla önskad vävnad med ett ljus eller laser9. Vid excitation bildas syreradikaler som orsakar endotelskada, vilket aktiverar trombocytaggregering och koagelbildning i det bestrålade området8,9. Den snäva kontrollen över slagstorlek och placering, liksom pt-modellens höga reproducerbarhet, gör den idealisk för att studera biomaterial. Medan precision möjliggörs med hjälp av en laser och stereotaxiska koordinater, finns det några nackdelar som kan göra denna modell mindre idealisk för få studier. Till skillnad från fMCAo-modellen kan PT-linjemodellen inte reperfuseeras. Därför skulle material för att undersöka neuroprotektiva medel som är specifika för skador efter reperfusion eller mekanismerna efter reperfusion inte vara användbara här8. Dessutom, på grund av den mikrovaskulära förolämpningen av PT-modellen, ses relativt liten ischemisk penumbra. Istället uppstår lokalt vasogent ödem, vilket är okarakteristiskt för mänsklig stroke, vilket gör denna modell oönskad för prekliniska läkemedelsstudier fokuserade på peri-infarktområdet6,8.
Det övergripande målet med biomaterialstrategier i stroke är att antingen leverera bioaktiva medel eller att fungera som en surrogat extracellulär matris för hjärnvävnadstillväxt. En strategi som vi kommer att utforska med våra metoder är att leverera hydrogel direkt in i strokekärnan, i motsats till peri-infarktvävnaden där många nuvarande cellterapier levereras10. Grunden för detta tillvägagångssätt är att leverans till den nekrotiska vävnaden som finns i kärnan kommer att undvika att störa den omgivande friska eller återhämtande vävnaden. Vi antar att diffusion av alla aktiva medel som ingår i biomaterialet kommer att kunna nå peri-infarct från kärnan, särskilt eftersom vi finner att leverans av hydrogelbiomaterial minskar tjockleken på gliaärret11. Detta är viktigt eftersom regionen peri-infarct har visat sig uppvisa neuroplasticitet efter stroke, vilket gör det till ett attraktivt mål. Dessutom kan leveransen av en surrogatmatris till slagkärnan laddas med angiogena12 eller neurogena13 faktorer för att styra bildandet av ny vävnad, liksom celler för leveransen14. Celltillförseln förbättras avsevärt genom att använda en matris eftersom den skyddar cellerna från de hårda injektionskrafterna och den lokala miljön som finns under leveransen, samt uppmuntrar differentiering och inympning15.
Dessa injicerbara terapeutiska biomaterial har klinisk relevans i stroke applikationer, eftersom det för närvarande inte finns några medicinska terapier som stimulerar neuronal återhämtning efter stroke. De underliggande neurala kretsarna som är involverade i återhämtning ligger i hjärnvävnad som ligger intill strokekärnan16, medan strokekärnan själv saknar livskraftig neural vävnad. Vi förväntar oss att leverans av ett biomaterial i den nekrotiska strokekärnan har potential att stimulera den intilliggande vävnaden mot regenerativa processer genom ett antal mekanismer som tidigare nämnts, inklusive depåutgivning av tillväxtfaktorer13,stimulering av vävnadstillväxt och främjande av återhämtning av hjärnvävnadsutveckling11,12,förändring av immunsvar17och leverans av stamcellsbaserade terapier14, 18. För att effektivt studera möjligheten till dessa tillämpningar behövs dock en konsekvent och reproducerbar metod för att inducera stroke och injicera biomaterial. PT-linjemodellen använder tekniker som ger exakt kontroll över orienteringen och platsen för slaget. En laser som är fäst vid den stereotaxiska enheten styr orienteringar, och pumpar som är anslutna till de stereotaxiska enheterna styr insprutningshastigheten för materialet utan att behöva ytterligare former av avbildning. Därför har vi valt att beskriva metoderna för att utföra en PT-stroke i mössens motoriska cortexer och för att injicera biomaterial i strokekärnan. Här använder vi mikroporösa glödgade partiklar (MAP) hydrogeler som biomaterial för injektion utan tillsatta celler eller tillväxtfaktorer. Dessutom förklarar vi hur man framgångsrikt hämtar hjärnan med intakt biomaterial, och vi diskuterar immunokemiska analyser som används för att analysera stroke resultatet med och utan injektion av biomaterial.
Här visar vi en lätt reproducerbar, minimalt invasiv, permanent stroke modell och beskriver hur man injicerar ett biomaterial i infarct fem dagar efter stroke. Användningen av det fototrobotiska färgämnet Rose Bengal och en 520 nm kollimerad laser ansluten till den stereotaxiska enheten ger oss möjlighet att placera slaget vid musens motorbark med förbättrad precision. Fem dagar efter stroke är infarktens placering synlig med ögat i centrum av bestrålning, 2,0 mm medio-lateral till bregma. Hydrogel injiceras s…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill uppmärksamma National Institutes of Health och National Institute of Neurological Disorders and Stroke för finansiering (R01NS079691).
10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax |
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
Student Adson Forceps -1×2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |