要在经济学研究中使用卡诺哈布迪炎(C.elegans),需要一种方法来生成大量蠕虫,其中单个样本可以在平台上测量以进行比较分析。在这里,提出了一种在大型文化板块(LSCPs)上培养C.elegans种群并记录人口增长的方法。
卡诺哈布迪炎(C.elegans)一直是并仍然是研究发育生物学、衰老、神经生物学和遗传学的宝贵模型有机体。大量关于C.elegans的研究使得它成为融入大量全动物研究以解剖复杂的生物成分及其与另一个生物体关系的理想候选者。为了在协作-经济学研究中使用C.elegans,需要一种方法来生成大量动物,其中单个样本可以在不同的平台上进行分解和检测,以便进行比较分析。
在这里,介绍了一种在大型文化板块(LSCP)上培养和收集大量混合阶段 C.elegans 种群的方法,以及随后的表型数据。这条管道产生足够的动物来收集表型和种群数据,以及-经济学实验(即基因组学、转录学、蛋白质组学和代谢学)所需的任何数据。此外,LSCP 方法要求对动物本身进行最少的操作,减少用户准备时间,提供严格的环境控制,并确保在整个研究过程中对每个样本的处理保持一致,以便全面可重复性。最后,介绍了在给定的LSCP中记录 C.elegans 生命阶段的人口规模和人口分布的方法。
C. elegans是一种小型自由生存线虫,在世界各地各种自然栖息地被发现。其相对容易生长、快速生成时间、生殖系统和透明的身体使其成为在发育生物学、衰老学、神经生物学和遗传学2、3中被广泛研究的强大模型生物体。大量关于C.elegans的研究使得利用-经济学研究将表型与复杂的生物成分及其在给定生物体中的关系全面联系起来成为最佳候选者。
为了在协作-经济学研究中使用C.elegans,需要一种方法来产生大量的动物混合阶段种群,其中一个样本可以拆分,并跨不同的平台和仪器用于比较分析。创建生成此类样本的管道需要敏锐地了解饮食、环境、压力、人口结构以及样本处理和收集。因此,必须将标准和可重复的栽培条件纳入大型管道。在C.elegans的研究中,两种传统方法被用来培养蠕虫——阿加·佩特里菜肴和液体培养4。
从历史上看,当需要大量的C.elegan时,它们生长在液体培养中。在液体培养中产生大量蠕虫的步骤需要多个处理步骤,通常包括漂白剂同步破裂的成年角质层,释放胚胎以达到所需的种群大小。然而,当使用漂白剂同步时,人口增长取决于开始人口普查的规模,因此影响随后的增长和人口数量。此外,C. elegans菌株的皮质敏感性、暴露时间和对漂白剂同步的压力反应也各不相同,因此很难在5、6、7、8、9时检测许多菌株。
此外,液体培养中的蠕虫生长需要几个转移步骤,因为通常建议在收获前只生长一代蠕虫,因为如果生长多代,很容易出现过度拥挤,并导致尽管存在食物10的dauer形成。道尔的形成通过小信号分子(如通常被称为”dauer信息素”)发生,11、12、13、14,被释放到液体介质中,影响人口的增长。此外,液体培养中大量蠕虫种群的增加会导致培养物中细菌积累过多,当下游表型检测需要清洁样本时,会产生困难。最后,当液体培养物被污染时,由于真菌孢子或细菌细胞很容易分散在媒体15中,因此更难维持。
种植 C.elegans 的另一种传统方法是在阿加·佩特里菜肴上。市售的Petry菜肴可以很容易地生长多代混合阶段蠕虫,而不会像液体培养物中那样,出现过度拥挤和高道尔形成的快速影响。然而,在传统的琼脂培养皿上,蠕虫生长的一个缺点是,最大的市售Petry菜不会产生大量的蠕虫种群进行-经济学研究,而不添加漂白剂同步步骤。总之,在阿加·佩特里菜肴上培养 C.elegans 的混合阶段种群更适合收集-经济学数据,但我们需要一种方法来产生非常大的人口规模,而无需液体培养。
在这里,我们提出了一种在大型文化板块(LSCP)上培养和收集大型混合阶段C.elegans种群的方法。通过这条管道收集样本可以产生足够的样本来收集表型和种群数据,以及-经济学实验(即基因组学、转录学、蛋白质组学和代谢学)所需的任何数据。此外,LSCP 方法要求对动物进行最少的操作,减少用户准备时间,提供严格的环境控制,并确保在整个研究过程中对每个样本的处理保持一致,以便整体可重复性。
各种船只可用作 LSCP。在此协议中,使用了标准玻璃烤盘。使用的 LSC 的外部尺寸为 35.56 x 20.32 厘米,内部尺寸为 27.94 x 17.78 厘米,深约 4.45 厘米,并配有合适的盖子。因此,这里使用的细菌量已优化为具有上述尺寸的 LSCP,以产生大量混合阶段蠕虫。细菌体积和浓度可以调整,以满足实验需要。
霉菌、真菌或其他细菌源的污染可能发生在 LSCP 方法的任何步骤中,因此要小心处理样品。在开始协议的任何步骤之前,请确保用 70% 乙醇和 10% 漂白剂清洁工作空间。如有,请用紫外线处理使用区域 30 分钟,并在开始每个步骤前 30 分钟打开 HEPA 空气过滤器。
通过在受控设置(即在 20 °C 的 CT 室中)中增长 LSCP,用户可以更轻松地跟踪样本的增长并记录潜在的污染。如果 LSCP 表面受到污染,请尽可能消除污染,如果污染无法控制,则让样品继续生长或丢弃样品。必须迅速解决污染问题,以减少不必要的增长,并确保它不会在资源方面胜过蠕虫。
这种方法是为那些谁想要发展大规模的混合人口文化 的C.elegans。虽然有可能像在市售的培养皿和液体培养物上那样,在LSCP上增加同步的蠕虫种群,但作者尚未测试这一选项。此外,如果用户希望在给定样本中平均生长超过 240 万蠕虫,则建议采用其他方法4。增长的成功取决于正在处理的压力。作者成功地在至少5个 15C.elegans 菌株的生物复制品中培育出大约240万只蠕虫,表明该方法是强大的。
在开始实验之前,需要注意的是,特定蠕虫的年龄和健康会影响体型和随后的人口增长时间。确保蠕虫在使用此管道之前保持健康,应力最小。假设库存样本已被创建、冷冻并保存在 -80 °C,以减少遗传漂移。
根据给定实验的需要,LSCP 上的开始受试成人的数量可以更改。改变LSCP上开始育成的成年人的数量将改变增长率,从而改变收获的时间。五个贪图的成年人被用来播种每个LSCP的原因如下:(1) 一种简单,快速和有效的方法,种子许多 C.elegans 菌株到LSCP一次是必要的:(2)以减少年龄差异的草根成人选择,可能导致生长异质性。
这种方法允许用户收获大量具有所有生命周期阶段的蠕虫。根据现有方法,收集大规模 C.elegans 样本需要漂白剂同步,以获得下游工作所需的蠕虫数量。鉴于这种方法,人们现在可以在发酵器或大型液体培养物中尽可能多地生长蠕虫,而不会遇到与漂白剂同步和多个处理步骤相关的困难。我们的协议允许人们有效地瞄准利益菌株,在生长样品本身时使用最少的处理时间,并根据下游管道中需要隔离蠕虫或种群的阶段。
利用LPFC作为工具,记录特定LSCP中的人口分布和规模。使用的LPFC是一个连续流动系统,根据蠕虫的大小(TOF)和光学密度分析、分类和分配蠕虫。当给定蠕虫穿过流动细胞时,轴向光损失探测器捕获了被 488 nm 固态激光阻断的信号光量,以延长蠕虫通过的时间长度,从而使用户获得蠕虫的 TOF 和光学密度。荧光收集光学和探测器还可用于最大限度地提高每个样品的荧光灵敏度和收集量。LPFC 收集参数将因仪器而异。用户可以使用各种平台来捕获蠕虫大小,如果 LPFC 不可用,则不限于使用此协议。
作者使用此处描述的方法中生长的样本,通过液相色谱学 -质谱学、NMR光谱学和RNA测序,识别各种 丙烯 酸盐菌株中的未知代谢物。作者计划继续使用这种方法在这条管道中用各种 C.elegans 菌株生长样品,因为新的感兴趣菌株可以很容易地使用这条管道进行处理。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢爱迪生实验室的成员对这份手稿的有益讨论和反馈;特别是B.M加西亚一些菌株由国家卫生研究院研究基础设施项目办公室(P40 OD010440)和CENDR提供,后者由NSF生活收藏CSBR 1930382资助。这项工作得到了国家卫生研究院(U2CES030167)的资助。
10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
Agar | Sigma | 05040-100G | |
Agarose | Sigma | A9539-500G | |
BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
Peptone | Sigma | P7750-100G | |
Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |