omics 연구에서 Caenorhabditis elegans (C. elegans)를사용하려면 비교 분석을 위해 플랫폼 간에 단일 샘플을 측정 할 수있는 많은 웜 인구를 생성하는 방법이 필요합니다. 여기서는 대규모 배양판(LSCP)에 대한 C. 예인대 인구를 배양하고 인구 증가를 문서화하는 방법이 제시된다.
Caenorhabditis elegans (C. elegans)는발달 생물학, 노화, 신경 생물학 및 유전학을 연구하는 귀중한 모델 유기체로 남아 있습니다. C. elegans에 대한 작업의 큰 몸은 복잡한 생물학적 구성 요소와 다른 유기체와의 관계를 해부하기 위해 대규모 인구, 전체 동물 연구에 통합하는 이상적인 후보입니다. 협업 -omics 연구에서 C. elegans를 사용하기 위해서는 비교 분석을 위해 다양한 플랫폼에서 단일 샘플을 분할하고 분석 할 수있는 많은 동물을 생성하는 방법이 필요합니다.
여기서, 대규모 배양판(LSCP)에 풍부한 혼합단계 C. 엘레간 집단을 배양하고 수집하는 방법과 후속 현상데이터가 제시된다. 이 파이프라인은 -omics 실험(예: 유전체학, 전사학, 프로테오믹스 및 메타볼로믹스)에 필요한 데이터와 함께 현상 및 인구 데이터를 수집하기에 충분한 수의 동물을 산출합니다. 또한 LSCP 방법은 동물 자체에 대한 최소한의 조작이 필요하며, 사용자 준비 시간이 적으며, 환경 제어를 강화하며, 전체 적인 재현성을 위해 연구 전반에 걸쳐 각 시료의 처리가 일관되도록 보장합니다. 마지막으로, 주어진 LSCP에서 C. elegans 생명 단계의 인구 규모 및 인구 분포를 문서화하는 방법이 제시됩니다.
C. elegans는 다양한 자연 서식지1에서전 세계적으로 발견되는 작은 자유로운 살아있는 선충입니다. 성장의 상대적 용이성, 빠른 세대 시간, 재생 시스템 및 투명한 신체는 발달 생물학, 노화, 신경 생물학 및 유전학2,3에서널리 연구된 강력한 모델 유기체입니다. C. elegans에 대한 풍부한 작업은 표현형을 복잡한 생물학적 구성 요소와 포괄적으로 연결하는 -omics 연구에서 사용할 수있는 유력한 후보이며 주어진 유기체에서의 관계를 포괄적으로 연결합니다.
협업 -omics 연구에서 C. elegans를 사용하려면 단일 샘플을 분할하고 비교 분석을 위해 다양한 플랫폼과 기기에서 사용할 수있는 동물의 큰 혼합 단계 인구를 생성하는 방법이 필요합니다. 이러한 샘플을 생성하기 위해 파이프라인을 만들려면 식단, 환경, 스트레스, 인구 구조 및 샘플 처리 및 수집에 대한 예리한 인식이 필요합니다. 따라서 대규모 파이프라인에 통합된 표준 및 재현 가능한 배양 조건을 갖는 것이 중요합니다. C. elegans 연구에서는 아가 페트리 요리와 액체 문화4– 두 가지 전통적인 방법은 벌레를 문화하는 데 사용됩니다.
역사적으로, 대량의 C. 예인이 필요할 때, 그들은 액체 배양4에서재배된다. 액체 배양에서 벌레의 큰 인구를 생성하는 관련시킨 단계는 수시로 중력 성자 큐티클을 파열하기 위하여 표백제 동기화를 포함하는 다중 취급 단계를 요구합니다, 원하는 인구 크기를 달성하기 위하여 태아를 풀어 놓습니다. 그러나 표백제 동기화를 사용하면 인구 증가가 인구 조사 시작 크기에 따라 달라지므로 후속 증가와 인구 수에 영향을 미칩니다. 또한, C. 예레간 균주는 표백제 동기화에 대한 큐티클 감도, 노출 시간 및 응력 반응에 따라 달라지므로 한 번에 많은 균주를 분석하기가 어렵고5,6,7,8,9.
또한, 액체 배양의 벌레 성장은 여러 세대에 걸쳐 자라면 쉽게 발생하고식품(10)의존재에도 불구하고 다이어 형성으로 이어질 수 있기 때문에 수확하기 전에 한 세대의 벌레만 성장하는 것이 좋습니다 때 몇 가지 전송 단계가 필요합니다. Dauer 형성은 종종 “dauer 페로몬”11,12,13,14라고도하는 소신호 분자를 통해 발생하며, 액체 매체로 방출되어 인구의 성장에 영향을 미친다. 더욱이, 액체 배양에서 큰 벌레 인구증가는 배양에 있는 과잉 박테리아 축적으로 이끌어 내고, 다운스트림 phenotypic 분석은 위해 깨끗한 견본이 필요할 때 어려움을 만듭니다. 마지막으로, 액체 배양이 오염되면 곰팡이 포자 나 세균 세포가배지(15)에걸쳐 쉽게 분산되기 때문에 유지가 더 어려워진다.
C. elegans를 재배하는 다른 전통적인 방법은 아가 페트리 요리에 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 Petri 접시를 사용하면 액체 배양에서 볼 수 있듯이 과밀과 높은 dauer 형성의 급속한 영향없이 여러 세대의 혼합 단계 벌레를 쉽게 성장시킬 수 있습니다. 그러나, 전통적인 한마페트리 요리에 벌레 성장에 단점은 가장 큰 상업적으로 사용할 수 페트리 접시표백제 동기화 단계에 추가하지 않고 -omics 연구에 대한 큰 벌레 인구를 산출하지 않는다는 것입니다. 요약하자면, 한천 페트리 접시에 C. elegans의 혼합 단계 인구를 배양하는 것은 -omics 데이터를 수집하는 데 더 적합하지만, 우리는 액체 배양없이 매우 큰 인구 크기를 생성하는 방법이 필요했습니다.
여기서는 대규모 배양판(LSCP)에서 대규모 혼합단계 C. 예레간 인구를 배양하고 수집하는 방법을 제시합니다. 이 파이프라인을 통해 샘플을 수집하면 -omics실험(예:유전체학, 전사학, 프로테오믹스 및 메타볼로믹스)에 필요한 데이터와 함께 현상 및 인구 데이터를 수집하기에 충분한 샘플을 얻을 수 있습니다. 또한 LSCP 방법은 동물의 최소한의 조작, 사용자 준비 시간 감소, 엄격한 환경 제어 제공, 전체 재현성을 위한 연구 전반에 걸쳐 각 시료의 처리가 일관되도록 보장합니다.
다양한 선박을 LSCP로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 표준 유리 베이킹 접시가 사용되었습니다. 사용 중 LSPC는 35.56 x 20.32cm의 외부 치수를 가지고 있었고, 내부 치수는 27.94 x 17.78cm, 깊이는 약 4.45cm이며 장착 된 뚜껑이 함께 있었습니다. 따라서, 여기서 사용되는 박테리아의 양은 상기 차원을 가진 LSCP에 최적화되어 혼합단계 벌레의 큰 집단을 산출한다. 세균의 부피 및 농도는 실험적 요구에 맞게 조절될 수 있다.
곰팡이, 곰팡이 또는 기타 세균성 소스에 의한 오염은 LSCP 방법의 모든 단계에서 발생할 수 있으므로 주의해서 샘플을 처리하십시오. 프로토콜의 단계를 시작하기 전에 작업 공간이 70 % 에탄올과 10 %의 표백제로 청소되었는지 확인하십시오. 사용 가능한 경우, 30분 동안 UV 광이 있는 중고 지역을 치료하고 각 단계를 시작하기 전에 30분 전에 HEPA 공기 필터를 켭니다.
제어된설정(즉,20°C로 설정된 CT 룸)에서 LSCP를 성장시킴으로써, 사용자는 시료의 성장을 보다 쉽게 추적하고 잠재적오염을 문서화할 수 있다. LSCP의 표면이 오염되면 가능한 경우 오염을 잘라내고 오염을 제어할 수 없는 경우 시료가 계속 성장하거나 폐기하도록 합니다. 원치 않는 성장을 줄이고 자원을 위해 웜을 능가하지 않도록 신속하게 오염을 해결하는 것이 필수적입니다.
이 방법은 C. elegans의대규모 집단 집단 문화를 성장시키고자하는 사람들을위한 것입니다. LSCP에서 의 경우와 같이 상업적으로 사용 가능한 페트리 접시와 액체 문화에서 와 같이 동기화된 웜 개체수를 늘릴 수 있지만 저자는 이 옵션을 테스트하지 않았습니다. 또한 사용자가 지정된 샘플에서 평균 약 240만 개 이상의 웜을 성장시키고자 하는 경우 다른 방법을 권장합니다4. 성장 성공은 파이프라인에서 처리되는 변형에 따라 달라집니다. 저자는 성공적으로 15 C. elegans 긴장의 적어도 5개의 생물학 복제에 있는 대략 2.4 백만 벌레의 인구를 증가할 수 있었습니다, 방법이 견고하다는 것을 나타내는.
실험을 시작하기 전에 주어진 웜의 나이와 건강은 fecundity 및 후속 인구 증가 시간에 영향을 미칠 수 있음을 주의합니다. 이 파이프라인에 사용되기 전에 최소한의 스트레스로 웜을 건강한 조건에서 유지관리합니다. 재고 샘플이 생성, 동결 및 시간이 지남에 따라 유전 드리프트를 줄이기 위해 -80 °C에서 보관된 것으로 가정됩니다.
주어진 실험의 필요에 따라 LSCP에서 중력 성인을 시작하는 횟수를 변경할 수 있습니다. LSCP에서 시작 중력 성인의 수를 변경하면 성장률이 변경되므로 수확 할 시간이 변경됩니다. 5명의 중력 성인은 다음과 같은 이유로 각 LSCP를 시드하는 데 사용됩니다: (1) 한 번에 많은 C. elegans 균주를 LSCP에 종자하는 간단하고 빠르며 효율적인 방법이 필요했으며 (2) 성장 이질성으로 이어질 수 있는 그레이드 성인들 사이의 나이 차이를 줄이기 위해 필요하였다.
이 방법을 사용하면 모든 수명 주기 단계가 있는 많은 웜 군수를 수확할 수 있습니다. 현재 방법을 사용할 수 있는 C. elegans의 대규모 샘플을 수집하려면 다운스트림 작업에 원하는 웜 수를 얻기 위해 표백제 동기화가 필요합니다. 이러한 접근법을 감안할 때, 이제 표백제 동기화 및 다중 처리 단계와 관련된 어려움 없이 발효기 또는 대규모 액체 배양에서 가능한 한 많은 벌레를 자랄 수 있습니다. 당사의 프로토콜을 사용하면 관심 있는 균주를 효율적으로 타겟팅하고, 샘플 자체를 성장하는 데 최소한의 처리 시간을 사용하고, 다운스트림 파이프라인에서 필요에 따라 웜 또는 인구의 단계를 격리할 수 있습니다.
LPFC는 지정된 LSCP에서 인구 분포와 크기를 문서화하는 도구로 활용되었습니다. 사용되는 LPFC는 크기(TOF) 및 광학 밀도를 기반으로 웜을 분석, 정렬 및 분배하는 연속 유량 시스템입니다. 주어진 웜이 유동 셀을 통과할 때, 축 광 손실 검출기는 벌레가 통과하는 데 걸리는 시간 동안 488 nm-솔리드 상태 레이저에 의해 차단된 신호광의 양을 포착하여 사용자에게 웜의 TOF 및 광학 밀도를 제공합니다. 형광 수집 광학 및 검출기는 각 샘플의 형광 감도 및 수집을 극대화하기 위해 활용 될 수 있습니다. LPFC 컬렉션 매개 변수는 계측기에 따라 다릅니다. 사용자는 웜 크기를 캡처하기 위해 다양한 플랫폼을 사용할 수 있으며 LPFC를 사용할 수 없는 경우 이 프로토콜을 사용하는 데 국한되지 않습니다.
저자는 액체 염색체를 통해 C. elegans의 각종 긴장에서 알려지지 않은 대사산물을 확인하기 위하여 여기에서 기술된 방법에서 성장한 견본을 이용하고 있습니다 – 질량 분광법, NMR 분광법 및 RNA 순서. 저자는 이 파이프라인을 사용하여 새로운 관심 있는 균주를 쉽게 처리할 수 있기 때문에 다양한 C. elegans 균주를 사용하여 이 파이프라인의 샘플 성장을 위해 이 방법을 계속 사용할 계획입니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 원고에 대한 유용한 토론과 피드백에 대한 Edison Lab의 회원들에게 감사드립니다. 특히, B.M. 일부 균주는 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40 OD010440)에 의해 투자되는 CGC와 NSF 생활 컬렉션 CSBR 1930382 의해 투자되는 CeNDR에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH (U2CES030167)의 보조금에 의해 지원되었다.
10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
Agar | Sigma | 05040-100G | |
Agarose | Sigma | A9539-500G | |
BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
Peptone | Sigma | P7750-100G | |
Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |