Præcis brain mapping til at udføre gentagne In Vivo Imaging af Neuro-Immune Dynamics i mus
Summary
Denne protokol beskriver en kronisk kraniel vindue implantation teknik, der kan bruges til langsgående billeddannelse af neuro-glio-vaskulære strukturer, interaktioner, og funktion i både sunde og syge betingelser. Det tjener som et supplerende alternativ til den transkranielle billeddannelse tilgang, der, mens ofte foretrækkes, har nogle kritiske begrænsninger.
Abstract
Centralnervesystemet (CNS) er reguleret af et komplekst samspil af neuronal, glia, stromale, og vaskulære celler, der letter dens rette funktion. Selv studere disse celler i isolation in vitro eller sammen ex vivo giver nyttige fysiologiske oplysninger; fremtrædende træk ved neuralcellefysiologi vil blive savnet i sådanne sammenhænge. Derfor er der behov for at studere neurale celler i deres oprindelige in vivo miljø. Protokollen detaljeret her beskriver gentagne in vivo to-foton billeddannelse af neurale celler i gnaver cortex som et redskab til at visualisere og studere specifikke celler over længere perioder fra timer til måneder. Vi beskriver i detaljer brugen af den groft stabile hjernevaskekulatur som et groft kort eller fluorescerende mærket dendritter som et fint kort over udvalgte hjerneregioner af interesse. Ved hjælp af disse kort som en visuel nøgle, viser vi, hvordan neurale celler kan præcist flyttes til efterfølgende gentagne in vivo imaging. Ved hjælp af eksempler på in vivo-billeddannelse af fluorescerende-mærket mikroglia, neuroner, og NG2+ celler, denne protokol viser evnen til denne teknik til at tillade gentagne visualisering af cellulære dynamik i samme hjerne placering over længere perioder, der kan yderligere støtte til at forstå de strukturelle og funktionelle reaktioner af disse celler i normal fysiologi eller efter sti fornærmelser. Hvor det er nødvendigt, kan denne tilgang kobles til funktionel billeddannelse af neurale celler, f.eks. Denne fremgangsmåde er især en kraftfuld teknik til at visualisere den fysiske interaktion mellem forskellige celletyper af CNS in vivo, når genetiske musemodeller eller specifikke farvestoffer med forskellige fluorescerende tags til at mærke de celler af interesse er tilgængelige.
Introduction
Centralnervesystemet (CNS) styres af et komplekst samspil mellem forskellige hjemmehørende celletyper, herunder neuroner, glia og kar-associerede celler. Traditionelt, neurale celler blev undersøgt i isolerede, co-kulturperler1,,2,,3,,4,,5 (in vitro) eller punkterede hjernevæv (ex vivo)6,,7,,8,,9,10 sammenhænge. Men der er behov for yderligere at forstå neurale celle adfærd og interaktioner i det oprindelige miljø af den intakte hjerne in vivo. I denne protokol beskriver vi en metode til at kortlægge in vivo-områder af interesse og præcist re-image disse regioner i fremtidige billedbehandlingssessioner for at spore de komplekse interaktioner mellem de forskellige CNS-celletyper over længere perioder.
Udviklingen af in vivo-billeddannelsesmetoder har givet betydelige gevinster for en korrekt forståelse af neural funktion11,12,13,14,15. Disse tilgange giver specifikt flere fordele i forhold til traditionelle in vitro- og ex vivo-metoder. For det første, in vivo billeddannelse systemer har fysiologisk relevante celle-og væv komponenter såsom vaskulaturen med det fulde repertoire af cellulære interaktioner til at give en komplet forståelse af neurale netværk fysiologi. For det andet, de seneste resultater tyder på, at når de fjernes fra deres oprindelige miljø, visse neurale celler (såsom mikroglia) mister vigtige elementer i deres identitet og dermed fysiologi16,17, som kan bevares i in vivo indstilling., For det tredje giver in vivo-billeddannelsessystemer mulighed for stabile langsgående undersøgelser fra uger til måneder for at studere CNS-celleinteraktioner. Endelig, i betragtning af den voksende dokumentation for bidrag fra det perifere immunsystem18,19 og mikrobiom20,21 i CNS fysiologi, in vivo-systemer giver en platform til at afhøre sådanne bidrag og virkninger på CNS-celler. Således tilgange, der anvender langsgående in vivo imaging at studere neuro-immune fysiologi og interaktioner i raske, sårede, og syge stater er en stor supplerende tilføjelse til traditionelle tilgange.
I denne protokol beskriver vi en pålidelig tilgang til billede forskellige celletyper i hjernen, herunder mikroglia, neuroner og NG2+ celler som eksempler. To tilgange til at visualisere neurale celler in vivo er blevet udviklet: den fortyndede kraniet tilgang og det åbne kranium med en kraniel vindue tilgang. Selv tyndet kraniet tilgange er i brug ogforetrækkes,fordi de overvinde nogle af ulemperne ved den åbne kraniet tilgang såsom gliacelle aktivering, højere end fysiologiske rygsøjlen dynamik og brugen af anti-inflammatoriske midler22,23,24,25, fortyndet kraniet tilgange viser også et par kritiske ulemper. For det første er udtyndingsproceduren en meget delikat procedure, som mange forskere har svært ved at perfektionere, især når genfortynding er nødvendig. Dette er tilfældet, fordi det ofte er vanskeligt for eksperimentatorer at fastslå, at de har fortyndet kraniet til en ~ 20 μm dybde. For det andet, for passende sammenligninger mellem mus, udtynding skulle være identiske og en række udtynding succes mellem billeddannelse sessioner eller mus kunne komplicere visualisering af neurale strukturer. For det tredje, når de anvendes til langsgående billeddannelse, dyr med fortyndede kranier kan kun bruges til et begrænset antal sessioner, når re-udtynding af kraniet er ansat. Forth, da nogle af knoglevævet stadig er tilbage, klarhed i dybden af billeddannelse kunne blive kompromitteret fra den fortyndede kraniet tilgang giver mulighed for stor visualisering af mere overfladisk, men ikke så meget med dybere regioner. I lyset af dette, dybere hjernestrukturer såsom hippocampus, kan ikke med held afbildet med den tyndede kraniet tilgang. Disse overvejelser rejser behovet for alternative og komplementære tilgange, der kan løse disse problemer.
Alternativ til den fortyndede kraniet tilgang, det åbne kranium vindue implantation tilgang bruger en procedure, hvor kraniet er erstattet med en optisk klar glas coverslip. Dette giver mulighed for et næsten ubegrænset antal billedbehandlingssessioner. Desuden, i betragtning af udskiftning af kraniet med glasset coverslip, denne metode giver mulighed for en klar visning vindue af fluorescerende mærkede hjerneceller i lange perioder fra timer til måneder, og derfor kan anvendes til at studere celleaktivitet og interaktioner, der er relevante for fysiologi, aldring og patologi.
Samlet set vi detaljer trin, der kan følges for at gøre implantat kronisk kraniel vinduer gennem en stereotaxic kraniotomi, der gør det muligt in vivo billeddannelse af hjernen regioner af interesse. Vi beskriver også, hvordan den groft stabile hjernevaskekulatur eller de fluorescerende mærket dendritter kan bruges til at generere et groft eller fint kort, henholdsvis af hjernen regioner af interesse. Denne fremgangsmåde kan derefter bruges til gentagne billedbehandling over flere sessioner. Betydningen af denne teknik, derfor ligger i dens evne til at billedet de langsigtede ændringer eller stasis i hjernen elementer, herunder arrangement, morfologi, og interaktioner af de forskellige cellulære typer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremkomsten af in vivo to-foton billeddannelse har åbnet muligheder for at udforske overflod af cellulære interaktioner og dynamik, der opstår i den sunde hjerne. Indledende undersøgelser fokuserede på at bruge den åbne kraniotomi tilgang til billedet neuronal dendritter af både akut og kronisk billeddannelse37,38. Dette kan også bruges til at belyse neuroimmune interaktioner i hjernen. Denne protokol beskriver en metode til pålidelig billeddannelse af f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer af Eyo lab for at diskutere de ideer, der præsenteres i dette manuskript. Vi takker Dr. Justin Rustenhoven fra Kipnis Lab på University of Virginia for gave NG2DsRed mus33. Dette arbejde er støttet af midler fra National Institute of Neurological Disorders and Stroke af National Institute of Health til U.B.E (K22 NS104392).
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
