رسم خرائط دقيقة للدماغ لأداء المتكررة في التصوير فيفو من ديناميات العصبية المناعية في الفئران
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية زرع نافذة القحفية المزمنة التي يمكن استخدامها للتصوير الطولي للهياكل العصبية-الدبقية-الأوعية الدموية، والتفاعلات، والوظيفة في كل من الظروف الصحية والمُرَضَّة. وهو بمثابة بديل تكميلي لنهج التصوير عبر الكريات الذي، رغم أنه يفضل في كثير من الأحيان، فإنه يمتلك بعض القيود الحرجة.
Abstract
وينظم الجهاز العصبي المركزي (CNS) من قبل تفاعل معقد من الخلايا العصبية، دغلي، stromal، والخلايا الوعائية التي تسهل وظيفتها السليمة. على الرغم من أن دراسة هذه الخلايا في عزلة في المختبر أو معا السابقين فيفو يوفر معلومات فسيولوجية مفيدة; سوف نفتقد السمات البارزة من علم وظائف الأعضاء العصبية الخلية في مثل هذه السياقات. لذلك، هناك حاجة لدراسة الخلايا العصبية في وطنهم في بيئة الجسم الحي. البروتوكول مفصلة هنا يصف المتكررة في الجسم الحي صورتين الفوتون من الخلايا العصبية في قشرة القوارض كأداة لتصور ودراسة خلايا محددة على مدى فترات طويلة من الزمن من ساعات إلى أشهر. نحن وصف بالتفصيل استخدام الأوعية الدموية الدماغ مستقرة بشكل صارخ كخريطة الخشنة أو التشعب المسمى الفلورسنت كخريطة دقيقة من مناطق الدماغ المختارة ذات الاهتمام. باستخدام هذه الخرائط كمفتاح مرئي، نُظهر كيف يمكن نقل الخلايا العصبية بدقة للتكرار اللاحقة في التصوير الجسمي. باستخدام أمثلة من التصوير في الجسم الحي من microglia المسمى الفلورسنتلي، والخلايا العصبية، وNG2+ الخلايا، وهذا البروتوكول يدل على قدرة هذه التقنية للسماح التصور المتكرر للديناميات الخلوية في نفس موقع الدماغ على مدى فترات زمنية طويلة، التي يمكن أن تساعد على مزيد من المساعدة في فهم الردود الهيكلية والوظيفية لهذه الخلايا في علم وظائف الأعضاء العادي أو بعد الشتائم المرضية. وعند الضرورة، يمكن أن يقترن هذا النهج بالتصوير الوظيفي للخلايا العصبية، على سبيل المثال، مع تصوير الكالسيوم. هذا النهج هو تقنية قوية خاصة لتصور التفاعل المادي بين أنواع الخلايا المختلفة من الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي عندما نماذج الماوس الجينية أو الأصباغ محددة مع علامات الفلورسنت مميزة لتسمية الخلايا ذات الاهتمام متوفرة.
Introduction
ويحكم الجهاز العصبي المركزي (CNS) من قبل تفاعل معقد من التفاعلات بين أنواع الخلايا المقيمة المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية، جاليا والخلايا المرتبطة بالأوعية. تقليديا، درست الخلايا العصبية في معزولة، شارك في استزراع1،,2،,3،,4،,5 (في المختبر) أو أنسجة الدماغ المخ المخ (السابق vivo)6،7،,8،,9،,10 سياقات., ومع ذلك، هناك حاجة إلى فهم مزيد من سلوك الخلية العصبية والتفاعلات في البيئة الأصلية للدماغ سليمة في الجسم الحي. في هذا البروتوكول، نحن وصف طريقة لرسم خريطة في المناطق vivo من الفائدة وإعادة بالضبط صورة تلك المناطق في المستقبل جلسات التصوير لتتبع التفاعلات المعقدة بين مختلف أنواع الخلايا CNS على مدى فترات طويلة من الزمن.
وقد وفرت تطوير في الأساليب التصوير في الجسم الحي مكاسب كبيرة للفهم السليم من وظيفة العصبية11،12،13،14،15. وتوفر هذه الأساليب على وجه التحديد مزايا عديدة على النهج التقليدية في المختبر وفي المختبر. أولاً، في أنظمة التصوير الحي لديها الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ومكونات الأنسجة مثل الأوعية الدموية مع ذخيرة كاملة من التفاعلات الخلوية لتوفير فهم كامل للفسيولوجيا الشبكة العصبية. ثانيا، تشير النتائج الأخيرة إلى أنه عند إزالتها من بيئتها الأصلية، تفقد بعض الخلايا العصبية (مثل ميكروجليا) ميزات هامة من هويتها، وبالتالي علم وظائف الأعضاء16،17 والتي يمكن الحفاظ عليها في وضع في الجسم الحي. ثالثاً، توفر أنظمة التصوير الحي الفرصة لإجراء تحقيقات طولية مستقرة من أسابيع إلى أشهر لدراسة التفاعلات الخلوية التي يقوم بها الجهاز العصبي المركزي. وأخيرا، ونظرا للأدلة المتزايدة للمساهمات من الجهاز المناعي الطرفي18،,19 والميكروبيوم20،21 في علم وظائف الأعضاء في الجهاز العصبي المركزي، في نظم الجسم الحي توفير منصة لاستجواب هذه المساهمات والآثار على خلايا الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، فإن النهج التي تستخدم الطولية في التصوير الجسمي لدراسة فسيولوجيا المناعة العصبية والتفاعلات في الدول الصحية والمصابة والمرضى هي إضافة تكميلية كبيرة إلى النهج التقليدية.
في هذا البروتوكول، ونحن وصف نهج موثوق به لصورة أنواع الخلايا المختلفة في الدماغ بما في ذلك microglia، والخلايا العصبية والخلاياNG2 + كأمثلة. وقد تم تطوير نهجين لتصور الخلايا العصبية في الجسم الحي: نهج الجمجمة رقيقة والجمجمة المفتوحة مع نهج نافذة الجمجمة. على الرغم من أن الأساليب رقيقة الجمجمة هي قيد الاستخدام ويفضل لأنها التغلب على بعض مساوئ نهج الجمجمة المفتوحة مثل تنشيط الخلايا الدبقية, أعلى من الفسيولوجية ديناميات العمود الفقري واستخدام العوامل المضادة للالتهابات22,23,24,25, كما تظهر ضعف الجمجمة النهج بعض العيوب الحرجة. أولاً، الإجراء ترقق هو إجراء دقيق جداً أن العديد من الباحثين يجدون صعوبة في الكمال خاصة عندما إعادة ترقق ضروري. هذا هو الحال لأنه غالبا ما يكون من الصعب على المجربين التأكد من أن لديهم رقيقة الجمجمة إلى عمق 20 μm~ . ثانياً، بالنسبة للمقارنات الكافية بين الفئران، فإن الترقق يجب أن يكون متطابقًا ويمكن لمجموعة متنوعة من النجاح في الترقق بين جلسات التصوير أو الفئران أن تعقد التصور للهياكل العصبية. ثالثاً، عندما تستخدم في التصوير الطولي، لا يمكن استخدام الحيوانات ذات الجماجم الرقيقة إلا لعدد محدود من الجلسات عند استخدام إعادة ترقق الجمجمة. جيئة وذهابا ، لأن بعض الأنسجة العظمية لا تزال قائمة ، يمكن أن يكون للخطر وضوح في عمق التصوير من نهج الجمجمة رقيقة مما يسمح لتصور كبير من أكثر سطحية ولكن ليس بقدر مع مناطق أعمق. في ضوء هذا، هياكل الدماغ أعمق مثل قرن آمون، لا يمكن أن تكون صورة بنجاح مع نهج الجمجمة رقيقة. وتثير هذه الاعتبارات الحاجة إلى نهج بديلة ومتكاملة يمكن أن تتغلب على هذه الشواغل.
بديل لنهج الجمجمة رقيقة، نهج زرع نافذة الجمجمة المفتوحة يستخدم إجراء الذي يتم استبدال الجمجمة مع غطاء زجاجي واضح بصريا. وهذا يسمح لعدد غير محدود تقريبا من جلسات التصوير. وعلاوة على ذلك ، نظرا لاستبدال الجمجمة مع غطاء الزجاج ، وهذا الأسلوب يسمح لنافذة عرض واضحة من خلايا الدماغ الموسومة الفلورسنت لفترات طويلة من المرات من ساعات إلى أشهر ، وبالتالي ، يمكن استخدامها لدراسة نشاط الخلية والتفاعلات التي هي ذات الصلة لعلم وظائف الأعضاء والشيخوخة وعلم الأمراض.
عموما، نحن تفاصيل الخطوات التي يمكن اتباعها للقيام زرع النوافذ القحفية المزمنة من خلال استئصال القحف ستيريو التي تمكن في التصوير الجسم الحي للمناطق الدماغ من الفائدة. كما نصف كيف يمكن استخدام الأوعية الدموية المستقرة بشكل صارخ أو التشعبات الفلورية المسماة لتوليد خريطة خشنة أو دقيقة ، على التوالي من مناطق الدماغ ذات الاهتمام. ويمكن بعد ذلك استخدام هذا الأسلوب للتصوير المتكرر على مدى عدة جلسات. وتكمن أهمية هذه التقنية في قدرتها على تصوير التغيرات الطويلة الأجل أو الركود في عناصر الدماغ بما في ذلك الترتيب، والمورفولوجيا، والتفاعلات بين الأنواع الخلوية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد فتحت ظهور التصوير في الجسم الحي 2 فوتون الفرص لاستكشاف عدد كبير من التفاعلات الخلوية والديناميات التي تحدث في الدماغ السليم. ركزت الدراسات الأولية على استخدام نهج استئصال القحف في الجمجمة المفتوحة إلى dendrites الخلايا العصبية صورة من قبل كل من التصوير الحاد والمزمن37,<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر إيو على مناقشة الأفكار المعروضة في هذه المخطوطة. نشكر الدكتور جاستن روستينهوفن من مختبر كيبنيس في جامعة فرجينيا على هدية فئرانNG2 DsRed 33. ويدعم هذا العمل من خلال تمويل من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية من المعهد الوطني للصحة إلى U.B.E (K22 NS104392).
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
