Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.
Abstract
Das Zentralnervensystem (ZNS) wird durch ein komplexes Zusammenspiel von neuronalen, gliaalen, stromalen und vaskulären Zellen reguliert, die seine ordnungsgemäße Funktion erleichtern. Obwohl die Untersuchung dieser Zellen isoliert in vitro oder zusammen ex vivo liefert nützliche physiologische Informationen; wichtige Merkmale der neuronalen Zellphysiologie werden in solchen Kontexten übersehen. Daher ist es notwendig, neuronale Zellen in ihrer nativen in vivo Umgebung zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die sich wiederholende In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung von Nervenzellen im Nagetierkortex als Werkzeug zur Visualisierung und Untersuchung bestimmter Zellen über einen längeren Zeitraum von Stunden bis Monaten. Wir beschreiben detailliert die Verwendung der grob stabilen Gehirnvaskulatur als grobe Karte oder fluoreszierend beschriftete Dendriten als feine Karte ausgewählter Hirnregionen von Interesse. Anhand dieser Karten als visuellen Schlüssel zeigen wir, wie neuronale Zellen für die nachfolgende repetitive In-vivo-Bildgebung präzise verlegt werden können. Anhand von Beispielen für die In-vivo-Bildgebung von fluoreszierend markierten Mikroglia, Neuronen und NG2+ Zellen demonstriert dieses Protokoll die Fähigkeit dieser Technik, eine sich wiederholende Visualisierung der zellulären Dynamik am selben Hirnort über längere Zeiträume zu ermöglichen, die weitere Hilfe beim Verständnis der strukturellen und funktionellen Reaktionen dieser Zellen in der normalen Physiologie oder nach pathologischen Beleidigungen unterstützen kann. Gegebenenfalls kann dieser Ansatz an die funktionelle Bildgebung von Nervenzellen gekoppelt werden, z. B. mit Kalziumbildgebung. Dieser Ansatz ist besonders eine leistungsstarke Technik, um die physikalische Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen des ZNS in vivo zu visualisieren, wenn genetische Mausmodelle oder bestimmte Farbstoffe mit unterschiedlichen fluoreszierenden Tags zur Kennzeichnung der gefährdeten Zellen verfügbar sind.
Introduction
Das zentralnervöse System (ZNS) wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen ansässigen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia und gefäßassoziierten Zellen, gesteuert. Traditionell wurden Neurozellen in isolierten, ko-kultivierten1,2,3,4,5 (in vitro) oder ausgeschnittenem Hirngewebe (ex vivo)6,7,8,9,10 Kontexte untersucht. Es ist jedoch notwendig, das Verhalten neuronaler Zellen und Interaktionen in der nativen Umgebung des intakten Gehirns in vivo weiter zu verstehen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, um in vivo-Regionen von Interesse abzubilden und diese Regionen in zukünftigen Imaging-Sitzungen genau neu abzubilden, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen ZNS-Zelltypen über einen längeren Zeitraum zu verfolgen.
Die Entwicklung von in vivo bildgebenden Ansätzen hat signifikante Gewinne für das richtige Verständnis der neuronalen Funktion11,12,13,14,15geliefert. Insbesondere bieten diese Ansätze mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen In-vitro- und Ex-vivo-Ansätzen. Erstens verfügen In-vivo-Bildgebungssysteme über physiologisch relevante Zell- und Gewebekomponenten wie die Vaskulatur mit dem gesamten Repertoire zellulärer Wechselwirkungen, um ein vollständiges Verständnis der neuronalen Netzwerkphysiologie zu ermöglichen. Zweitens deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass bestimmte Nervenzellen (wie Mikroglia) wichtige Merkmale ihrer Identität und damit die Physiologie16,17 verlieren, die in der in vivo-Einstellung erhalten werden können, wenn sie aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt werden. Drittens bieten In-vivo-Bildgebungssysteme die Möglichkeit für stabile Längsuntersuchungen von Wochen bis Monaten, um z.B. zelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen. Angesichts der zunehmenden Hinweise auf Beiträge des peripheren Immunsystems18,19 und des Mikrobioms20,21 in der ZNS-Physiologie bieten In-vivo-Systeme eine Plattform, um solche Beiträge und Wirkungen auf ZNS-Zellen zu befragen. Daher sind Ansätze, die Längs-in-vivo-Bildgebung verwenden, um neuroimmune Physiologie und Wechselwirkungen in gesunden, verletzten und kranken Zuständen zu untersuchen, eine große komplementäre Ergänzung zu traditionellen Ansätzen.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen zuverlässigen Ansatz, um verschiedene Zelltypen im Gehirn abzubilden, einschließlich Mikroglia, Neuronen und NG2+ Zellen als Beispiele. Es wurden zwei Ansätze zur Visualisierung von Nervenzellen in vivo entwickelt: der ausgedünnte Schädelansatz und der offene Schädel mit einem Schädelfensteransatz. Obwohl verdünnte Schädelansätze im Einsatz sind und bevorzugt werden, weil sie einige der Nachteile des offenen Schädelansatzes überwinden, wie z.B. Glialzellaktivierung, überphysiologische Wirbelsäulendynamik und die Verwendung von entzündungshemmenden Mitteln22,23,24,25, verdünnte Schädelansätze zeigen auch einige kritische Nachteile. Erstens ist das Ausdünnungsverfahren ein sehr heikles Verfahren, das viele Forscher nur schwer perfektionieren können, vor allem, wenn eine erneute Ausdünnung notwendig ist. Dies ist der Fall, weil es für Experimentatoren oft schwierig ist, festzustellen, dass sie den Schädel auf eine Tiefe von 20 m ausgedünnt haben. Zweitens müsste für angemessene Vergleiche zwischen Mäusen die Ausdünnung identisch sein, und eine Vielzahl von Ausdünnungserfolgen zwischen Bildgebungssitzungen oder Mäusen könnte die Visualisierung neuronaler Strukturen erschweren. Drittens können Tiere mit verdünnten Schädeln bei Verwendung bei der Längsbildgebung nur für eine begrenzte Anzahl von Sitzungen verwendet werden, wenn eine erneute Ausdünnung des Schädels zum Einsatz kommt. Forth, da ein Teil des Knochengewebes noch erhalten bleibt, könnte die Klarheit in der Tiefe der Bildgebung durch den ausgedünnten Schädelansatz beeinträchtigt werden, der eine großartige Visualisierung von oberflächlicheren, aber nicht so viel mit tieferen Regionen ermöglicht. Vor diesem Hintergrund können tiefere Hirnstrukturen wie der Hippocampus nicht erfolgreich mit dem ausgedünnten Schädelansatz abgebildet werden. Diese Überlegungen werfen die Notwendigkeit alternativer und ergänzender Ansätze auf, die diese Bedenken ausräumen könnten.
Alternativ zum ausgedünnten Schädelansatz verwendet der Ansatz der offenen Schädelfensterimplantation ein Verfahren, bei dem der Schädel durch einen optisch klaren Glasdeckel ersetzt wird. Dies ermöglicht eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Bildgebungssitzungen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode aufgrund des Ersatzes des Schädels durch den Glasdeckel ein klares Sichtfenster fluoreszierender Gehirnzellen für längere Zeit von Stunden bis Monaten und kann daher eingesetzt werden, um Zellaktivität und Wechselwirkungen zu untersuchen, die für Physiologie, Alterung und Pathologie relevant sind.
Insgesamt beschreiben wir Schritte, die befolgt werden können, um chronische Schädelfenster durch eine stereotaxic-Kraniotomie zu implantieren, die in vivo-Bildgebung von Hirnregionen von Interesse ermöglicht. Wir beschreiben auch, wie die grob stabile Gehirnvaskulatur oder die fluoreszierend markierten Dendriten verwendet werden könnten, um eine grobe oder eine feine Karte bzw. der Hirnregionen von Interesse zu erzeugen. Dieser Ansatz kann dann für wiederholte Bildgebung über mehrere Sitzungen verwendet werden. Die Bedeutung dieser Technik liegt daher in ihrer Fähigkeit, die langfristigen Veränderungen oder Stase in Gehirnelementen einschließlich der Anordnung, Morphologie und Wechselwirkungen der verschiedenen zellulären Typen abzubilden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Aufkommen der in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung hat Möglichkeiten eröffnet, die Fülle von zellulären Interaktionen und Dynamiken zu erforschen, die im gesunden Gehirn auftreten. Erste Studien konzentrierten sich auf die Verwendung des offenen Schädel-Craniotomie-Ansatzes zur Bildneuronaldendriten durch akute und chronische Bildgebung37,38. Dies kann auch verwendet werden, um neuroimmune Wechselwirkungen im Gehirn zu klären. Dieses Protokoll beschreibt ei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Eyo-Labors für die Diskussion der in diesem Manuskript vorgestellten Ideen. Wir danken Dr. Justin Rustenhoven vom Kipnis Lab der University of Virginia für das Geschenk von NG2DsRed Mäusen 33. Diese Arbeit wird durch Fördermittel des National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health to U.B.E (K22 NS104392) unterstützt.
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
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