चूहों में न्यूरो-इम्यून डायनेमिक्स के वीवो इमेजिंग में दोहराव करने के लिए सटीक ब्रेन मैपिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल एक पुरानी कपाल खिड़की प्रत्यारोपण तकनीक का वर्णन करता है जिसका उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों स्थितियों में न्यूरो-ग्लियो-वैस्कुलर संरचनाओं, बातचीत और कार्य के देशांतर इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। यह ट्रांसक्रैनियल इमेजिंग दृष्टिकोण के पूरक विकल्प के रूप में कार्य करता है, जबकि अक्सर पसंद किया जाता है, कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं होती हैं।
Abstract
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को न्यूरोनल, ग्लियल, स्ट्रोमल और संवहनी कोशिकाओं के जटिल परस्पर क्रिया द्वारा विनियमित किया जाता है जो इसके उचित कार्य को सुविधाजनक बनाता है। हालांकि इन कोशिकाओं का अध्ययन इन कोशिकाओं में विट्रो में अलगाव या एक साथ पूर्व वीवो उपयोगी शारीरिक जानकारी प्रदान करता है; तंत्रिका कोशिका शरीर विज्ञान की मुख्य विशेषताएं ऐसे संदर्भों में याद किया जाएगा। इसलिए वीवो वातावरण में अपने मूल में तंत्रिका कोशिकाओं का अध्ययन करने की आवश्यकता है। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल कृंतक प्रांतस्था में तंत्रिका कोशिकाओं के वीवो दो-फोटॉन इमेजिंग में दोहराए जाने का वर्णन करता है ताकि घंटे-घंटों से महीनों तक समय की विस्तारित अवधि में विशिष्ट कोशिकाओं की कल्पना और अध्ययन किया जा सके। हम विस्तार से एक मोटे नक्शे के रूप में घोर स्थिर मस्तिष्क vasculature के उपयोग का वर्णन या फ्लोरोसेंटी ब्याज के चुनिंदा मस्तिष्क क्षेत्रों का एक अच्छा नक्शा के रूप में dendrites लेबल । एक दृश्य कुंजी के रूप में इन नक्शे का उपयोग करना, हम दिखाते हैं कि कैसे तंत्रिका कोशिकाओं को वीवो इमेजिंग में बाद में दोहराव के लिए ठीक से जगह दी जा सकती है। फ्लोरोसेंटली-लेबल माइक्रोग्लिया, न्यूरॉन्स और एनजी 2+ कोशिकाओं के वीवो इमेजिंग के उदाहरणों का उपयोग करके, यह प्रोटोकॉल इस तकनीक की क्षमता को दर्शाता है ताकि विस्तारित समय अवधि के साथ एक ही मस्तिष्क स्थान में सेलुलर गतिशीलता के दोहराव वाले दृश्य की अनुमति दी जा सके, जो सामान्य शरीर विज्ञान या निम्नलिखित पैथोलॉजिकल अपमान में इन कोशिकाओं की संरचनात्मक और कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को समझने में और सहायता कर सकता है। जहां आवश्यक हो, इस दृष्टिकोण को कैल्शियम इमेजिंग के साथ तंत्रिका कोशिकाओं की कार्यात्मक इमेजिंग के साथ युग्मित किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण वीवो में सीएनएस के विभिन्न सेल प्रकारों के बीच शारीरिक बातचीत की कल्पना करने के लिए विशेष रूप से एक शक्तिशाली तकनीक है जब आनुवंशिक माउस मॉडल या विशिष्ट रंगों को अलग फ्लोरोसेंट टैग के साथ ब्याज की कोशिकाओं को लेबल करने के लिए उपलब्ध हैं।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) न्यूरॉन्स, ग्लिया और पोत से जुड़े कोशिकाओं सहित विभिन्न निवासी सेल प्रकारों के बीच बातचीत के एक जटिल परस्पर क्रिया द्वारा नियंत्रित होता है। परंपरागत रूप से, तंत्रिका कोशिकाओं का अध्ययन अलग- अलग, सह-संस्कारी1,,2,,3,,4,,5 (इन विट्रो) या उत्पादित मस्तिष्क ऊतक (पूर्व वीवो)6,7,,8,,,9,,10 संदर्भों में किया गया था। हालांकि, वीवो में बरकरार मस्तिष्क के मूल वातावरण में तंत्रिका कोशिका व्यवहार और बातचीत को और समझने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, हम रुचि के वीवो क्षेत्रों में मानचित्रण करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और भविष्य के इमेजिंग सत्रों में उन क्षेत्रों को ठीक से फिर से छवि देते हैं ताकि विस्तारित अवधि में विभिन्न सीएनएस सेल प्रकारों के बीच जटिल बातचीत को ट्रैक किया जा सके।
वीवो इमेजिंग दृष्टिकोणों के विकास ने तंत्रिका कार्य 11 ,12 , 13,,,1414,,15की उचित समझ के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान किया है ।15 विशेष रूप से, ये दृष्टिकोण पारंपरिक इन विट्रो और पूर्व वीवो दृष्टिकोणों पर कई फायदे प्रदान करते हैं। सबसे पहले, वीवो इमेजिंग सिस्टम में तंत्रिका नेटवर्क फिजियोलॉजी की पूरी समझ प्रदान करने के लिए सेलुलर इंटरैक्शन के पूर्ण प्रदर्शनों की सूची के साथ वैक्यूलेचर जैसे शारीरिक रूप से प्रासंगिक कोशिका और ऊतक घटक होते हैं। दूसरा, हाल के निष्कर्षों से पता चलता है कि जब उनके मूल वातावरण से हटा दिया जाता है, तो कुछ तंत्रिका कोशिकाएं (जैसे माइक्रोग्लिया) अपनी पहचान की महत्वपूर्ण विशेषताएं खो देती हैं और इस प्रकार शरीर विज्ञान16,,17 जिसे वीवो सेटिंग में संरक्षित किया जा सकता है। तीसरा, वीवो इमेजिंग सिस्टम में सीएनएस सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए हफ्तों से महीनों की स्थिर देशांतर जांच का अवसर प्रदान करता है। अंत में, परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली18,19 और माइक्रोबायोम20,,सीएनएस फिजियोलॉजी में21 से योगदान के लिए बढ़ते सबूतों को देखते हुए, वीवो सिस्टम में सीएनएस कोशिकाओं पर ऐसे योगदान और प्रभावों से पूछताछ करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।, इस प्रकार, दृष्टिकोण है कि वीवो इमेजिंग में देशांतर रोजगार के लिए न्यूरो प्रतिरक्षा शरीर विज्ञान और स्वस्थ, घायल, और रोगग्रस्त राज्यों में बातचीत का अध्ययन पारंपरिक दृष्टिकोण के लिए एक महान पूरक इसके अलावा हैं ।
इस प्रोटोकॉल में, हम उदाहरण के रूप में माइक्रोग्लिया, न्यूरॉन्स और एनजी 2+ कोशिकाओं सहित मस्तिष्क में विभिन्न कोशिका प्रकारों की छवि के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। वीवो में तंत्रिका कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए दो दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं: पतली खोपड़ी दृष्टिकोण और एक कपाल खिड़की दृष्टिकोण के साथ खुली खोपड़ी। यद्यपि पतली खोपड़ी दृष्टिकोण उपयोग में हैं और पसंद किए जाते हैं क्योंकि वे खुले खोपड़ी दृष्टिकोण के कुछ नुकसानों जैसे ग्लियल सेल सक्रियण, उच्च-से-शारीरिक रीढ़ की गतिशीलता और विरोधी भड़काऊ एजेंटों के उपयोग को दूर करते हैं22,,23,24,,25,पतली खोपड़ी दृष्टिकोण भी कुछ महत्वपूर्ण कमियां दिखाते हैं।, सबसे पहले, पतली प्रक्रिया एक बहुत ही नाजुक प्रक्रिया है कि कई शोधकर्ताओं को सही करने के लिए मुश्किल लगता है, खासकर जब फिर से पतला आवश्यक है । यह मामला है क्योंकि प्रयोगकर्ताओं के लिए यह पता लगाना अक्सर मुश्किल होता है कि उन्होंने खोपड़ी को ~ 20 माइक्रोन गहराई तक पतला कर दिया है। दूसरा, चूहों के बीच पर्याप्त तुलना के लिए, पतले होने के लिए समान होने की आवश्यकता होगी और इमेजिंग सत्र या चूहों के बीच विभिन्न प्रकार की पतली सफलता तंत्रिका संरचनाओं के दृश्य को जटिल बना सकती है। तीसरा, जब देशांतर इमेजिंग के लिए कार्यरत है, पतली खोपड़ी के साथ जानवरों को केवल सत्र की एक सीमित संख्या के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब खोपड़ी के फिर से पतला कार्यरत है । आगे, के बाद से हड्डी ऊतक के कुछ अभी भी रहता है, इमेजिंग की गहराई में स्पष्टता पतली खोपड़ी अधिक सतही के महान दृश्य के लिए अनुमति दृष्टिकोण से समझौता किया जा सकता है, लेकिन गहरे क्षेत्रों के साथ ज्यादा नहीं । इस के प्रकाश में, हिप्पोकैम्पस जैसे गहरे मस्तिष्क संरचनाओं को पतला खोपड़ी दृष्टिकोण के साथ सफलतापूर्वक चित्रित नहीं किया जा सकता है। ये विचार वैकल्पिक और पूरक दृष्टिकोणों की आवश्यकता को बढ़ाते हैं जो इन चिंताओं को दूर कर सकते हैं ।
पतली खोपड़ी दृष्टिकोण के लिए वैकल्पिक, खुली खोपड़ी खिड़की प्रत्यारोपण दृष्टिकोण एक प्रक्रिया है जिसमें खोपड़ी एक ऑप्टिकली स्पष्ट ग्लास कवरस्लिप के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है का उपयोग करता है । यह इमेजिंग सत्रों की एक के पास असीमित संख्या के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, ग्लास कवरलिप के साथ खोपड़ी के प्रतिस्थापन को देखते हुए, यह विधि घंटों से महीनों तक समय की व्यापक अवधि के लिए फ्लोरोसेंटली टैग की मस्तिष्क कोशिकाओं की एक स्पष्ट देखने की खिड़की के लिए अनुमति देती है और इसलिए, कोशिका गतिविधि और बातचीत का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है जो शरीर विज्ञान, उम्र बढ़ने और विकृति के लिए प्रासंगिक हैं।
कुल मिलाकर, हम उन चरणों का विस्तार करते हैं जिनका पालन स्टीरियोटैक्सिक क्रैनियोटॉमी के माध्यम से पुरानी कपाल खिड़कियों को प्रत्यारोपित करने के लिए किया जा सकता है जो ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों के वीवो इमेजिंग में सक्षम बनाता है। हम यह भी वर्णन करते हैं कि कैसे मोटे मस्तिष्क वास्कुलेचर या फ्लोरोसेंटी लेबल वाले डेनड्राइट्स का उपयोग ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों के क्रमशः एक मोटे या ठीक नक्शे को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग तब कई सत्रों में दोहराए जाने वाले इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का महत्व, इसलिए, विभिन्न सेलुलर प्रकारों की व्यवस्था, आकृति विज्ञान और बातचीत सहित मस्तिष्क तत्वों में दीर्घकालिक परिवर्तन या स्टेसिस को छवि देने की क्षमता में निहित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वीवो दो फोटॉन इमेजिंग में आगमन ने स्वस्थ मस्तिष्क में होने वाली सेलुलर इंटरैक्शन और गतिशीलता की अधिकता का पता लगाने के अवसर खोले हैं। प्रारंभिक अध्ययनों में एक्यूट और क्रॉनिक इमेजिंग37,<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विचारों पर चर्चा करने के लिए Eyo प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम वर्जीनिया विश्वविद्यालय में किपनिस लैब से डॉ जस्टिन रुस्टेनहोवेन को एनजी 2डीएसरेड चूहों ३३के उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं । यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर्स एंड स्ट्रोक ऑफ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ से यूएबीई (K22 NS104392) के वित्तपोषण द्वारा समर्थित है।
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
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