यहां प्रस्तुत स्तनधारी कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन लेबलिंग और तरल चरण स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए ग्राफीन के साथ नमूना कोटिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है । विकिरण के कारण होने वाले नुकसान के खिलाफ नमूनों की स्थिरता का भी इस प्रोटोकॉल के साथ अध्ययन किया जा सकता है।
स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) का उपयोग करके स्तन कैंसर कोशिकाओं की बरकरार प्लाज्मा झिल्ली में मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (HER2) की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। स्तनधारी स्तन कैंसर सेल लाइन SKBR3 की कोशिकाओं सिलिकॉन नाइट्राइड (SiN) खिड़कियों के साथ सिलिकॉन माइक्रोचिप्स पर उगाया गया । कोशिकाओं को रासायनिक रूप से तय किया गया था, और HER2 प्रोटीन क्वांटम डॉट नैनोकणों (QDs) के साथ लेबल थे, एक दो कदम बायोटिन-streptavidin बाध्यकारी प्रोटोकॉल का उपयोग कर । कोशिकाओं को एक हाइड्रेटेड राज्य बनाए रखने के लिए मल्टीलेयर ग्राफीन के साथ लेपित किया गया था, और स्टेम के दौरान इलेक्ट्रॉन बीम क्षति से बचाने के लिए । इलेक्ट्रॉन बीम विकिरण के तहत नमूनों की स्थिरता की जांच करने के लिए, एक खुराक श्रृंखला प्रयोग किया गया था। ग्राफीन-लेपित और गैर-लेपित नमूनों की तुलना की गई। बीम प्रेरित क्षति, उज्ज्वल कलाकृतियों के रूप में, बढ़ी हुई इलेक्ट्रॉन खुराक डीमें कुछ गैर-लेपित नमूनों के लिए दिखाई दी, जबकि लेपित नमूनों पर कोई कलाकृतियों दिखाई नहीं दी ।
झिल्ली प्रोटीन समारोह का विश्लेषण सेल जैविक अनुसंधान के लिए, और दवा के विकास के लिए आवश्यक है। महत्वपूर्ण प्रयोगों के एक वर्ग कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन पदों की परीक्षा शामिल है। इस जानकारी का उपयोग प्रोटीन परिसरों में प्रोटीन की असेंबली और प्लाज्मा झिल्ली में उनके विशिष्ट स्थानों के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए किया जा सकता है, जो गतिशील असेंबली और अलग-अलग के माध्यम से, विभिन्न प्रकार के सेलुलर कार्यों को चलाता है। अन्य तकनीकों के अलावा, कोशिकाओं में प्रोटीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एलएम) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) का उपयोग किया जाता है। एलएम तरल में पूरी कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देता है; हालांकि, संकल्प पारंपरिक के लिए 200-300 एनएम तक ही सीमित है और व्यावहारिक परिस्थितियों1,2 के तहत सुपर रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए20एनएम तक . EM लगभग 1 Å संकल्प3प्रदान करता है, लेकिन पारंपरिक नमूना तैयारी के लिए निर्जलीकरण, छवि के विपरीत को बढ़ाने के लिए धातु धुंधला, और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)4के लिए राल जैसे बढ़ते पदार्थ में एम्बेडिंग की आवश्यकता होती है। अधिक देशी जैसे वातावरण में जैविक नमूनों को संरक्षित करने के लिए, क्रायो-ईएम तकनीकों का उपयोग5,,6किया जा सकता है। नमूने तेजी से असंगत बर्फ में जमे हुए हैं, और, यदि आवश्यक हो, तो अनुभागित । एक अन्य विकल्प फ्रीज-फ्रैक्चरिंगईएम 7है।
अपने मूल, तरल राज्य में अक्षुण्ण कोशिकाओं के भीतर झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए EM तकनीक पिछले एक दशक में8,,9,10, 11,11में उभरा है ।, क्वांटम डॉट (क्यूडी) पर 2 एनएम का स्थानिक संकल्प प्राप्त किया गया था , जिसमें सीएन झिल्ली पर उगाई जाने वाली पूरी कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन लेबल किया गया था और ग्राफीन9की एक परत से घिरा हुआ था।
यहां, प्रोटीन लेबलिंग और ग्राफीन कोटिंग9,,12 के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण वर्णित है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य हाइड्रेटेड राज्य में कोशिकाओं को संरक्षित करते हुए पूरे, निश्चित कोशिकाओं की झिल्ली में HER2 के स्थानिक वितरण का विश्लेषण करना है। ग्राफीन के साथ कोटिंग वैक्यूम में कोशिकाओं को सूखने से रोकता है, और विकिरण क्षति को भी कम करता है13। यह विधि बरकरार प्लाज्मा झिल्ली के भीतर लेबल झिल्ली प्रोटीन के बारे में जानकारी प्रदान करती है, लेकिन विधि सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन करने के लिए उपयोगी नहीं है जैसा कि आमतौर पर ईएम के साथ किया जाता है।
ग्राफीन सबसे पतला नैनोमटेरियल जाना जाता है, और एक कार्बन परमाणु मोटी क्रिस्टलीय शीट एक हनीकॉम्ब जाली14में व्यवस्थित होते हैं । इसमें उच्च लचीलापन और यांत्रिक शक्ति सहित अद्वितीय गुण हैं। हाल के शोध से पता चला है कि दोष मुक्त ग्राफीन गैसों और तरल पदार्थों के लिए अभेद्य है, लेकिन दोष हाइड्रोजन पारमेशन15की अनुमति देते हैं । यहां इस्तेमाल किए जाने वाले मल्टीलेयर ग्राफीन का इस्तेमाल कर इस लीकेज को कम किया जा सकता है। बाइलेयर ग्राफीन ने हाल ही में क्रायो-ईएम नमूनों के लिए एक समर्थन के रूप में उपयोगी दिखाया है, ग्राफीन ऑक्साइड की तुलना में पतली बर्फ की परत की एकरूपता में सुधार जहां केवल गैर-वर्दी परतों का गठन किया जा सकता है16। ग्राफीन को तरल चरण संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी13,17के दौरान जैविक नमूनों की बीम क्षति को कम करने के लिए भी दिखाया गया था । एक अनुकरणीय प्रयोग के रूप में, HER2 स्तनधारी स्तन कैंसर सेल लाइन SKBR3 में व्यक्त QDs18 और उसके स्थानिक वितरण स्टेम का उपयोग कर दर्ज के साथ लेबल किया गया था । कोशिकाओं को एक एसआई माइक्रोचिप पर वरीयता दी गई थी जिसमें इलेक्ट्रॉन पारदर्शी एसआईएन झिल्ली19थी । माइक्रोचिप्स को समर्थन के रूप में चुना गया था क्योंकि वे एलएम और ईएम के साथ मजबूत, संगत हैं, और पूरी लेबलिंग प्रक्रिया सीधे माइक्रोचिप19पर की जा सकती है। सेल अटैचमेंट के बाद, HER2 को दो-स्टेप लेबलिंग प्रोटोकॉल20के साथ लेबल किया गया था। सबसे पहले, एक बायोटिनाइलेटेड एंटी-HER2 एंटीबॉडी मिमेटिक कंपाउंड21 HER2 से जुड़ा हुआ था। तब कोशिकाओं को रासायनिक रूप से लेबल-प्रेरित रिसेप्टर क्लस्टरिंग को रोकने और सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर की स्थिरता बढ़ाने के लिए तय किया गया था। स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित क्यूडी को बाद में HER2-एंटीबॉडी मिमेटिक कॉम्प्लेक्स से जोड़ा गया। क्यूडीएस के उज्ज्वल फ्लोरेसेंस सिग्नल और इलेक्ट्रॉन-घने कोर ने सहसंबद्ध फ्लोरेसेंस-और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (CLEM)20की अनुमति दी । CLEM विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि स्टेम विश्लेषण के लिए ब्याज के सेलुलर क्षेत्रों अवलोकन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं पर HER2 के स्थानीयकरण पर प्रकाश डाला छवियों से चुना जा सकता है । कोशिकाओं को उच्च HER2 स्तरों के साथ सेलुलर क्षेत्रों की पहचान करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । इसके बाद, ग्राफीन की 3-5 परत मोटी चादर को9,,22कोटिंग के लिए कोशिकाओं पर स्थानांतरित कर दिया गया था। बाद में, नमूना एक EM नमूना धारक में मुहिम शुरू की गई थी। स्टेम डेटा वलयाकार डार्क फील्ड (ADF) डिटेक्टर का उपयोग कर प्राप्त किया गया था, सेल सतह स्थान के सापेक्ष सेल सतह पर HER2 के स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन सेल के अल्ट्रास्ट्रक्चर के बारे में कोई जानकारी नहीं दे रही है । इलेक्ट्रॉन बीम विकिरण के तहत नमूने की स्थिरता निर्धारित करने के लिए, नमूनों की जांच एक छवि श्रृंखला में खुराक(डी)बढ़ाने पर की गई थी। ग्राफीन-लेपित और गैर-लेपित नमूनों के बीच अंतर की जांच की गई। कई प्रकार के विकिरण क्षति का मूल्यांकन किया गया।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल HER2 23 को लक्षित करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्तनधारी स्तन कैंसर सेल लाइन SKBR3 का उपयोग करताहै। प्रोटोकॉल में एक ग्राफीन-लेपित नमूने की तैयारी, और एक समान नमूना शामिल है लेकिन तुलना के लिए ग्राफीन कोटिंग के बिना। प्रयोग डुप्लिकेट में तैयार किया जाता है क्योंकि एसआईएन विंडो हर बार एक बार टूट सकती है, और ज्यादातर मामलों में एक प्रयोगात्मक डुप्लिकेट प्राप्त करने के लिए। विधि की समग्र उपज उच्च अर्थ है कि ग्राफीन कवर कोशिकाओं के साथ माइक्रोचिप्स आमतौर पर एक असाधारण त्रुटि के साथ प्राप्त किए जाते हैं, भले ही पूरे एसआईएन विंडो को सभी मामलों में ग्राफीन के साथ कवर नहीं किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में डुप्लीकेट का वर्णन नहीं किया गया है।
लेबलिंग प्रोटोकॉल (चरण 1-5) पहले24प्रकाशित COS7 फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर के लेबलिंग के प्रोटोकॉल के बराबर है; उस कागज में विवरण माइक्रोचिप्स की हैंडलिंग, और अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग के बारे में संदर्भित कर रहे हैं । निम्नलिखित प्रोटोकॉल को HER2 लेबलिंग, ग्राफीन कोटिंग9,और नमूने की विकिरण सहिष्णुता की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
प्रोटीन फ़ंक्शन को बेहतर ढंग से समझने के लिए, बरकरार कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन स्थानों के बारे में जानकारी प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। इस जानकारी को प्राप्त करने के तरीकों में सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी1,2शामिल हैं। हालांकि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी आगे पिछले वर्षों में विकसित किया गया है, इसका संकल्प अभी भी सेल प्रयोगों की व्यावहारिक स्थितियों के लिए लगभग 20 एनएम तक ही सीमित है, जबकि ठेठ रिसेप्टर प्रोटीन 1-10 एनएम की सीमा में आकार है । प्रोटीन की कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प के साथ एकल कोशिका और एकल अणु स्तर पर प्रोटीन की इमेजिंग ईएम के साथ संभव है। लेकिन खंड के कारण, पारंपरिक ईएम विधियां आमतौर पर कोशिका को बरकरार नहीं छोड़ती हैं26,जो प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन के संदर्भ और स्थानिक वितरण के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के नुकसान की ओर ले जाती है। क्रायो-टेम के साथ पूरी कोशिकाओं के लिए विधियां विकसित की गई हैं6,क्रायो-ईएम27के साथ प्रोटीन लेबलिंग को जोड़ना संभव है, क्रायो-स्टेम का प्रदर्शनभी 28को किया गया है। हालांकि, क्रायो-ईएम वर्कफ्लो को सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर और प्रोटीन संरचना का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जाता है, और झिल्ली प्रोटीन स्थानिक वितरण का विश्लेषण करने के लिए इतना नहीं। महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने एक और पूरी सेल तैयार करने की विधि है, लेकिन नमूने कई सुखाने कदम के अधीन हैं, और तकनीक अत्यधिक समय लेने वाली29है । फ्रीज फ्रैक्चर7के माध्यम से झिल्ली प्रोटीन की भी जांच की गई है । इस विधि में, कोशिकाओं को ठीक किया जाता है, जमे हुए और खंडित किया जाता है। खंडित भागों कार्बन और प्लेटिनम परतों द्वारा दोहराया जाता है, और जैविक नमूना हटा दिया जाता है । इसके बाद ईएम30के साथ प्रतिकृतियों का विश्लेषण किया जा सकता है । फ्रीज अंश के साथ पूरे सेल विश्लेषण असंभव है क्योंकि पूरे सेल के संदर्भ में झिल्ली में प्रोटीन के वितरण के बारे में जानकारी खो जाती है।
यहां प्रस्तुत विधि कोशिका झिल्ली को नमूने9,,31को पतला करने की आवश्यकता के बिना अध्ययन करने की अनुमति देती है। कोशिकाओं को बरकरार रखा जाता है ताकि झिल्ली प्रोटीन का स्थानीयकरण फ्लोरेसेंस छवियों से दिखाई दे, जो ईएम छवियों के साथ सहसंबद्ध हैं। हाइड्रेटेड अवस्था में अक्षुण्ण कोशिकाओं के भीतर एकल कोशिका और एकल अणु स्तर पर प्रोटीन का अध्ययन करना इस ग्राफीन बाड़े विधि9का उपयोग करके क्यूडी लेबल वाले प्रोटीन के स्टेम का उपयोग करके 2 एनएम के संकल्प के साथ संभव हो पाया है । कोशिकाओं को उनके मूल राज्य में रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह झिल्ली प्रोटीन के स्थानिक वितरण को बरकरार रखता है जैसे कि एकल कोशिका और एकल अणु स्तर पर विश्लेषण संभव है, जो प्रोटीन कार्यों को समझने और चिकित्सा दृष्टिकोण के लिए नई दवाओं का विकास करने के लिए महत्वपूर्ण है।
EM के साथ इमेजिंग जैविक नमूनों का एक और महत्वपूर्ण पहलू इलेक्ट्रॉन बीम की वजह से नमूनों के विकिरण क्षति है। समाधानों में अक्सर इलेक्ट्रॉन की खुराक में कमी या विभिन्न कोटिंग विधियों को शामिल किया जाता है, जैसे कि कार्बन32की पतली परतों के बीच नमूने को संलग्न करना। हमारी विधि से पता चलता है कि ग्राफीन कोटिंग बीम-प्रेरित कलाकृतियों को कम करती है जो गैर-लेपित नमूनों के लिए कोशिका की सतह पर निकलती हैं। रासायनिक रूप से तय की गई जांच, और ग्राफीन लेपित जैविक नमूनों की जांच 200 केवी बीम ऊर्जा पर इलेक्ट्रॉन बीम विकिरण के तहत डी = (7.8 ± 0.4) x 103 ई–/Å 2 विकिरण क्षति के बिना संभव है, जैसे उज्ज्वल धब्बे, नमूने पर दिखाई दे रहा है। अन्य ईएम विधियों की तुलना में, जिसमें विस्तृत नमूना तैयारी शामिल है, उदाहरण के लिए, धुंधला, एम्बेडिंग, (क्रायो-) सेक्शनिंग, फ्रैक्चरिंग, आदि, यहां वर्णित विधि कम समय लेने वाली है। प्रोटीन की लेबलिंग कुछ ही घंटों के भीतर की जाती है, और ग्राफीन कोटिंग के लिए प्रशिक्षित शोधकर्ताओं के लिए केवल लगभग 15 मिनट की आवश्यकता होती है। नमूना तैयारी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं के साथ तुलनीय है।
प्रोटोकॉल को कुछ चरणों में संशोधित किया जा सकता है। माइक्रोचिप पर ग्राफीन को हवा में सुखाने के लिए भी हवा में सुखाने के लिए सुनिश्चित करें कि ग्राफीन एक फिल्टर पेपर के साथ दाग होने पर आगे नहीं बढ़ता है। यदि ग्राफीन नमक से दूषित है, तो नमक को भंग करने के लिए इसे लगभग एक घंटे तक पानी की सतह पर तैरने देना संभव है और इस प्रकार संदूषण को कम करना संभव है। ग्राफीन पर होने वाले तांबा या पीएमएमए संदूषण को प्रोटोकॉल में संबंधित नक़्क़ाशी चरणों का विस्तार करके कम किया जा सकता है। अन्य ग्राफीन कोटिंग विधियों का वर्णन किया गया है जहां, उदाहरण के लिए, ग्राफीन-पीएमएमए सीधे कोशिकाओं पर जमा किया गया था, और पीएमएमए को बाद में33एसीटोन में धोने से हटा दिया गया था। हमारी विधि में, अतिरिक्त एसीटोन धोने के चरणों के कारण कोशिकाओं को किसी भी संभावित नुकसान से बचने के लिए कोटिंग से पहले पीएमएमए को हटा दिया गया था। NaCl यहां एक सब्सट्रेट के रूप में चुना गया था क्योंकि यह सपाट है, इसलिए यह ग्राफीन को शिकन नहीं देता है, और यह ग्राफीन 9 को छोड़ने के लिए पानी में घुलजाताहै। इसके अलावा, इसे वांछित आकार में काटा जा सकता है और ग्राफीन पर कोई सब्सट्रेट अवशेष नहीं बचे हैं। लेकिन उन मानदंडों को ध्यान में रखते हुए, पोटेशियम क्लोराइड जैसे अन्य सब्सट्रेट्स संभवतः भी इस्तेमाल किए जा सकते हैं।
संभावित लेबल-प्रेरित क्लस्टरिंग की संभावना को कम करने के लिए, एफए निर्धारण के बाद जीए निर्धारण चरण को सीधे लागू किया जा सकता है, जिसके बाद सभी झिल्ली प्रोटीन स्थिर होते हैं। एफए के साथ पहला निर्धारण कदम पहले से ही जैविक संरचना को ठीक करता है लेकिन झिल्ली प्रोटीन प्रसार का एक कम स्तर अभी भी34हो सकता है, संभवतः प्रति क्यूडी कई स्ट्रेप्टाविडिन की उपस्थिति के कारण लेबल प्रेरित क्लस्टरिंग के लिए अग्रणी है। GA के साथ निर्धारण एलएम के दौरान एक ऑटोफ्लोरेसेंस संकेत का कारण बन सकता है, और इसलिए, वर्णित प्रोटोकॉल में एलएम के बाद किया जाता है, लेकिन कहीं और वर्णित34के रूप में कम किया जा सकता है। Cacodylate बफर काफी विषाक्त है, और अन्य फिक्सेटिव्स का उपयोग भी किया जा सकता है, लेकिन यहां कैकोडिलेट का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह ईएम प्रोटोकॉल के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला बफर है, उपजी से बचाता है, बैक्टीरियल और कवक के विकास को रोकता है, और कैल्शियम आयनों के साथ संगत है जो लिपिड झिल्ली35की अल्ट्रास्ट्रक्चरल अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। यदि आवश्यक हो, तो लिपिड को स्थिर करने के लिए ऑस्मिम टेट्रोक्साइड का उपयोग अतिरिक्त निर्धारण के रूप में किया जा सकता है। यह सेल संरचना के विपरीत को बढ़ाने में मदद करेगा, लेकिन सिस्टम में एक और धातु भी जोड़ेगा और क्यूडी पर प्राप्त कंट्रास्ट को कम करेगा।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में कई कदम हैं जिन्हें अच्छे निर्देश की आवश्यकता होती है। माइक्रोचिप्स की एसआईएन सतह को खरोंचने से बचने और टूटने से रोकने के लिए माइक्रोचिप्स को संभालने से पहले कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, डुप्लिकेट में माइक्रोचिप्स तैयार करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि एसआईएन विंडो समय-समय पर टूट सकती है। माइक्रोचिप पर कोशिकाओं की आवश्यक संख्या प्राप्त करने के लिए भी कुछ अनुभव की आवश्यकता है। ग्राफीन के साथ कोशिकाओं को कोटिंग कुछ प्रशिक्षण की जरूरत है क्योंकि पानी पर ग्राफीन तैरने के लिए सही झुकाव कोण खोजना मुश्किल हो सकता है। पानी से ग्राफीन को पकड़ने पर पतले ग्राफीन को देखना भी मुश्किल हो सकता है। जैसे ही ग्राफीन माइक्रोचिप पर होता है, अतिरिक्त पानी को फिल्टर पेपर के साथ बंद करने की आवश्यकता होती है। यह केवल एक फिल्टर पेपर की नोक के साथ किया जाना चाहिए जैसे माइक्रोचिप से ग्राफीन को हटाने से बचने के लिए।
ग्राफीन कोटिंग ने कलाकृतियों को नमूने पर प्रदर्शित होने से रोका। लेकिन डी & 4 x 102 ईके लिए-/Å2 भी गैर-लेपित नमूने के लिए कोई कलाकृतियों उभरा, और कलाकृतियों केवल 2 गैर लेपित नमूनों के लिए दिखाई दिया । इस प्रकार, गैर-लेपित कोशिकाओं की परीक्षाएं भी संभव लगती हैं, हालांकि ग्राफीन का उपयोग करना और विरूपण साक्ष्य गठन के जोखिम से बचना बेहतर होगा। उन कलाकृतियों की संरचना का भविष्य में विश्लेषण किया जा सकता है ताकि उनके गठन को रोकने के बारे में संकेत दिया जा सके। कोशिकाओं की संरचनात्मक स्थिरता के बारे में केवल ग्राफीन कोटिंग का मामूली सुधार देखा गया था। निश्चित कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से जांचे गए पतले क्षेत्रों में स्थिर किया गया था, जहां उनकी संरचना एसआईएन झिल्ली के करीब निकटता में थी। हालांकि, हमने यहां जो जांच नहीं की, वह कलाकृतियों को सुखाने वाली थी जो वैक्यूम4के संपर्क में आने पर सेलुलर नमूनों के लिए होने के लिए जानी जाती हैं। कोशिकाओं के सूखने से कोशिकाओं का सिकुड़ना होगा ताकि क्यूडी की दूरियां भी परिणामस्वरूप बदल जाएं । यहां इस्तेमाल होने वाली इलेक्ट्रॉन डोज के लिए ग्राफीन-लेपित और नॉन-कोटेड नमूनों के क्यूडी की दूरी स्थिर रही। ईएम के लिए कोशिकाओं पर ग्राफीन कोटिंग के प्रभाव की जांच करने के लिए आगे के अध्ययनों की आवश्यकता है।
इस विधि की एक सीमा यह है कि कोशिकाओं का रासायनिक निर्धारण आवश्यक है; इसलिए, कोई जीवित सेल प्रयोग नहीं किया जा सकता है। लेकिन यदि लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है और उच्च संरचनात्मक स्थिरता वाली कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए बैक्टीरिया, तो अनिर्धारित कोशिकाओं को ईएम36 के लिए ग्राफीन में संलग्न किया जा सकता है हालांकि एक अलग इलेक्ट्रॉन खुराक सहिष्णुता के साथ। इसके अलावा, प्रोटीन सीधे पता लगाने योग्य नहीं हैं, इसलिए प्रोटीन की कल्पना करने के लिए क्यूडी की आवश्यकता होती है। विधि छोटे लेबल से लाभ होगा । चर्चा का एक मुद्दा यह है कि क्या यह अच्छा है या बुरा है कि अल्ट्रास्ट्रक्चर स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं दे रहा है । हमारी विधि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के समान है जहां केवल चयनित प्रोटीन ही दिखाई देते हैं37. अल्ट्रास्ट्रक्चर की दृश्यता बढ़ाने से छवि को और अधिक जानकारी भी मिलेगी, और फिर कुछ बिंदु पर व्यक्तिगत लेबल पदों का पता लगाने से रोका जा सकेगा। इसके अलावा, यहां वर्णित विधि एक प्रोटीन प्रजातियों के लिए है, और प्रोटोकॉल के अतिरिक्त कई प्रोटीन लेबल करने में सक्षम होने की जरूरत है । अंत में, विधि तब काम करती है जब एक छोटी उच्च आत्मीयता विशेष रूप से बाध्यकारी अणु जैसे एंटीबॉडी मिमेटिक21 या ना कोई नहीं38 उपलब्ध है। आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी बहुत बड़ा कर रहे हैं और ओलिगोमर में प्रोटीन उपइकाओं की कार्यात्मक स्थिति का पता लगाने को रोकने होगा।
हमारी विधि हाइड्रेटेड राज्य में कोशिकाओं को रखते हुए EM का उपयोग करते हुए पूरी कोशिकाओं पर प्रोटीन समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। कोशिकाओं की श्रृंखला की जांच करना आसानी से संभव है। अन्य प्रकार की कोशिकाओं और प्रोटीन का भी अध्ययन किया जा सकता है। यदि प्रोटीन लेबलिंग की आवश्यकता नहीं है, तो प्रोटोकॉल के सबसेट का उपयोग विभिन्न प्रकार के जैविक नमूनों के ग्राफीन कोटिंग के लिए किया जा सकता है। आणविक स्तर पर झिल्ली प्रोटीन समारोह के सहसंबंधों को समझने के लिए पूरी कोशिकाओं का अध्ययन करने की क्षमता सेलुलर अनुसंधान में प्रासंगिक है।
The authors have nothing to disclose.
हम सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ मदद के लिए डी बी Peckys शुक्रिया अदा करते हैं, पांडुलिपि की समीक्षा के लिए एफ Weinberg, प्रयोगों और आंकड़ों के साथ मदद के लिए टी Trampert, आंकड़ों के साथ मदद के लिए एस Smolka, और ई. Arzt INM के माध्यम से अपने समर्थन के लिए । इस शोध को अन्यक्रांत क्रानर-फ्रेसेनियस-स्टिफतुंग द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 2626-1L | |
AL54 analytical balance | Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany | 30029077 | |
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | 0163.2 | |
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM | Affibody, Solna, Sweden | 10.0817.02.0001 | |
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F | JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany | ||
Boric Acid | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | B6768-500G | |
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | 5169.1 | |
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696781 | |
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696782 | |
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696792 | |
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696794 | |
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 658170 | |
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188271 | |
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 627861 | |
Centrifuge 5418 | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 5401000010 | |
Centrifuge Tubes 50 ml sterile | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 7696705 | |
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution | Corning, NY, USA | 25-056-CI | |
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 9286.1 | |
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | PK36.1 | |
Easypet | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 4430000018 | |
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 – 2.5 µl | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000012 | |
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000039 | |
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 – 100 µl | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000047 | |
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 – 1000 µl | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 2222-1L | |
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | F8141 | |
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 | Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | ||
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | FisherScientific, Hampton, NH, USA | 31966021 | |
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) | FisherScientific, Hampton, NH, USA | 10099141 | lot number: 1751893 |
Gibco Goat Serum, New Zealand origin | FisherScientific, Hampton, NH, USA | 16210064 | lot number: 1788320 |
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
Galaxy 48R CO2 Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | CO48310001 | |
Gatan Model 950 Solarus Plasma Cleaner | Gatan GmbH, München, Germany | ||
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | G5882 | |
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | T873.1 | |
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED | Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | DM IL LED | |
Hot plate | Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany | MR 3002 | |
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine | Biowest, Nuaillé, France | X0557-100 | |
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm | DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main | ||
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752 | |
MSc-Advantage Class II Biological Safety Cabinet | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | ||
Ocean Microchips SiN window 400×150 µm, 200 nm spacer | DENSsolutions, Delft, The Netherlands | ||
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) | B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 | purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe |
Oven | Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany | VO 200 | |
Parafilm | VWR, Darmstadt, Germany | #291-0057 | |
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15710 | |
Perfekt-Kescher with handle | Plano GmbH, Wetzlar, Germany | T5112 | |
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 2-200µl: 7695892 | |
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887 | |
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 – 150.000 | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | P4707 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM | Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | Q10121MP | |
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased | Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA | 94-0451 | |
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm | Schleicher & Schuell, Dassel, Germany | 300212 | |
Routine stereo Microscope Leica M60 | Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | M60 | |
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) | Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1 | |
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553 | |
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) | Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany | 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555 | |
Shaking water bath SW22 | Julabo GmbH, Seelbach, Germany | 9550322 | |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | HN00.1 | |
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm | International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA | 9750 | |
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | S9640-500G | |
Sodium persulfate | carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | 4365.2 | |
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | P668.1 | |
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm | ACS material, Pasadena, CA, USA | TTG30011 | |
Tweezers Dumoxel 03 | Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland | 0103-7-PO | |
Tweezers Inox 02 | Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland | 0102-7-PO | |
Tweezers, plastic replaceable tip | Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland | 5SVR.SA | |
Water ROTISOLV HPLC gradient grade | Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany | A511.2 |