여기에 소개된 Na+/K+ 펌프및 동적 클램프를 사용하여 거머리 심장 인터뉴런의 지속적인 Na+ 전류의 역할을 조사하는 방법이 있습니다.
Na+/ K+ 펌프는 종종 뉴런 활동에서 배경 기능으로 생각, Na + ([Na+] i)의내부 농도에 반응 하는 외류 전류(I펌프)를기여. 리듬운동을 생성하는 중앙 패턴 발생기(CPG) 뉴런 네트워크에서 발견되는 뉴런과 같은 파열뉴런에서 [Na+]i 및 I 펌프는 버스트 사이클 전반에 걸쳐 달라질 것으로 예상될 수 있다. 멤브레인 전위로부터의 독립성과 결합된 전기 활동에 대한 이러한 반응성은 채널 기반 전류(예: 전압 또는 송신기 게이트 또는 누설 채널)에 흔하지 않은 동적 특성을 가진 i 펌프를 제공합니다. 더욱이, 많은 뉴런에서, 펌프의 활동은 다양한 변조기에 의해 변조되어, 리듬 파열 활동에서 내가펌프의 잠재적 인 역할을 더욱 확장한다. 이 백서는 모델링 및 동적 클램프 방법의 조합을 사용하여 CPG에서 지속적인 Na+ 현재의 리듬 활동에 영향을 미치는 방법을 결정합니다. 특히,이 논문은 약용 거머리의 심장 신경 신경에 동적 클램프 프로토콜 및 계산 모델링 방법에 초점을 맞출 것이다.
거머리의 심장 박동은 많은 중간 체세그먼트 신경질에 걸쳐 분포 심장 interneurons (HNs)의 9 양측 쌍으로 구성된 CPG에 의해 구동된다. CPG의 핵심은 반중심 발진기(HKO)를 형성하는3rd 및 4단층 신경리아에 위치한 인터뉴런의 상호 억제 쌍(도1A)이다. 이러한 뉴런은 비큐컬라인1을사용하여 약리학적으로 합성적으로 분리될 때 계속 파열됩니다. 7단 국고(이 프로토콜의 초점)의 쌍과 같은 다른 것들은 합성적으로 분리될 때 파열된 활동을 생성할 수 있는 터퍼입니다. 그들은 상호 연결되지 않고 내림차순 입력만 수신하므로 신경 코드의 나머지 부분에서 신경절을 분리하여 쉽게 격리됩니다. 이러한 독립적인 파열 활동은 레코딩을 위한 날카로운 미세 전극으로 침투하여 발생하는 유입전류에 민감하지만 느슨한 패치 방법1로기록될 때 격렬하게 파열된다.
개별 HN 뉴런과 HN HKO 모두 모델링(호지킨-Huxley 계 단일 등색형 구획 모델 모두 실험적으로 확인된 전압 게이트 및 시냅스 전류를 포함하는 HN 뉴런의 단일 등산구 모델) 및 살아있는 시스템의 모든 버스트 특성이 성공적으로 포착되었다2. 거머리의 내인성 신경펩티드인 Myomodulin은 고립된 HN 뉴런과 HN HKO의 파열 리듬의 기간(T)을 현저히 감소시합니다. 이 변조기는 h-전류(과극 활성화 내전류, I hh)를증가시키고 펌프3을감소시키는 역할을 한다. 이 관찰은 내가펌프가 Ih와상호 작용하는 방법과 공동 변조가 HN 뉴런의 리듬 활동에 어떻게 기여하는지에 대한 탐구로 이어졌습니다. [Na+]i(이오노포레 모넨신을 사용하여)를 증가시켜 펌프의 활성화는 HN HKO와 고립된 HN 뉴런4모두에서 HN 버스트 리듬을 가속화한다. 이 속도 향상은 Ih에 의존하였다. 그러나, 버스트 지속시간(BD)은 축소되었고, 인터버스트 간격(IBI)은 HN HKO와 고립된 HN 뉴런4모두에서 증가했다.
이 프로토콜의 경우, 펌프 전류를 포함한 살아있는 HN(7) 뉴런의 모든 전류가 다음과 같이 HN 모델에 통합된다.
(1)
여기서 C는 막 정전용량(nF)인 경우, V는 멤브레인 전위(V), t는 시간(s)이다. 자세한 이온 전류 설명 및 방정식은 다른 곳에서 설명되었습니다2,4. 완전한 HN 모델 뉴런은 실시간으로 실행됩니다(그림2). 이 소프트웨어는 게시 시 GitHub에서 사용할 수 있으며 재료 표에 설명된 디지털 신호 처리 보드에서 실행하는 것이 적합합니다. 여기서문의 초점은 Na+/K+ 펌프 전류(Ipump)및 전압 게이트 전류가 중요한 Na+ 플럭스를 기여합니다: 빠른 Na+ 전류(INa)및 영구 Na+ 전류(IP). 이러한 전류의 최대 전도도는
각각 다수입니다. Na+/K+ 펌프는 두 개의 세포 외 K+ 이온에 대한 세 개의 세포 내 Na+ 이온을 교환하여 순 바깥쪽 전류를 생성합니다. 중요 한 것은, 그것은 펌프 3 배 많은 Na+ 이 전류가 나타내는 대로 뉴런에서, 세포 내 Na+ 농도 계산에 중요 하다.
Na+/K+ 펌프 전류는 세포 내 Na+ 농도에 따라 다르며 다음과 같은 시그로이드 기능에 의해 표현됩니다.
(2)
여기서 [Na]i는 세포내 나+ 농도이고, 최대 나+/ K+ 펌프 전류이며, [Na]ih는 Na+K+ 펌프의 반 활성화를 위한 세포내 Na+ 농도이며, [Na]는 Na+/K+ 펌프의 감도이다 [ Na]i. [Na]I P와 I Na에 의해 운반되는 Na+ 유입의 결과로 빌드하고 Na+/ K+ 펌프의 Na+ efflux에 의해 감소됩니다. 총 Na+ 플럭스로I h와 누출의기여는 작고 실시간 모델에서는 고려되지 않습니다.
(3)
여기서, v는 세포내 Na+ 저수지의 부피(~6.7pL)이며, F는 패러데이의 일정하며, 세포외 Na+ 농도는 일정하게 유지됩니다.
전압 게이트 및 누출 전도도는 분화되어 왔으며- 계산된 세포내 Na+ 농도([Na+]i)에의해 조절되는 펌프 전류로부터 멤브레인 전위에 반응한다. 【 Na+】 나는 빠른 Na+ 전류(INa)를통해 Na+ 항목을 통해 구축되어 동작 잠재력 (스파이크)과 스파이크를 지원하는 탈극화를 제공하는 지속적인 Na+ 전류(IP)를생성합니다. 【 Na+】 나는 차례로, Na+의압출을 통해 펌프의 작용에 의해 감소된다 . 기준생활HN값(5nS)과
(150nS)가 가정되었으며, 추가된 동적 클램프를
고려한다.
여기에 설명된 프로토콜의 목표는 단일 HN에서 리듬 파열을 제어하기 위해 전압 게이트 전류(현재 프로토콜의 영구 Na+ 전류)와 상호 작용하는 방법을 발견하기 위해 실시간으로 정밀하고 가역적으로 펌프를 조작하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해 동적 클램프가 사용되었으며, 이 클램프는 명령시 모델이 실행중일 때 계산할 수 있는 전류의 정확한 양을 인위적으로 도입했습니다. 이 방법은 전체 조직에 영향을 미치는 펌프의 약리학적 조작에 비해 장점이 있으며, 종종 되돌리기 어렵고 정확하게 조작할 수 없는 오프 타겟 효과가 있을 수 있습니다. 동적 클램프5,6은 기록된 뉴런의 전압을 실시간으로 판독(도1B)하고,모델 방정식및 임의 또는 임의의 세트값에 기초한 전류의 양을 실시간으로 계산및 주입한다.
유사한 방법은 세포내로 기록될 수 있는 모든 뉴런에 쉽게 적용될 수 있다. 그러나, 매개 변수는 선택된 신경으로 재확장되어야 할 것이고, 뉴런은 시냅스 입력, 예를 들면, 약리학적으로 격리되어야 합니다.
모델링, 동적 클램프 및 이들이 활성화하는 결과 분석은 이온 전도도/전류의 개별 및 그룹이 뉴런의 전기 적 활성에 어떻게 기여하는지 탐구하는 데 유용한 기술이다(그림1, 도 2, 도4,그림 5). 이러한 기술의 사용은 Na+/K+ 펌프 전류(I펌프)가전압 게이트 전류, 특히 영구 Na+ 전류(IP)와상호 작용하여 거머리 심장 박동 패턴 생성기의 코어 HN에서 견고한 파열을 촉진하는 방법을 보여줍니다. 동적 클램프 실험과 모델링을 결합하여 일반 전압 레코딩 및 전류 클램프 기술로 가능한 것보다 모델을 보다 직접적으로 테스트할 수 있습니다. 동적 클램프실험(그림 5)에서수집된 결과는 HN 모델을 더욱 구체화하는 데 사용될 것이다. 여기서 입증된 동적 클램핑의 기본 방법은 신경 전류의 수학적 모델이 전압 클램프 실험으로 결정될 수 있는 경우 연구 하에 있는 모든 뉴런의 특성을 반영하도록 사용자 지정할 수 있다.
여기에 도시된 타입의 실험의 성공적인 완성은 전기전극 침투1에의해 강한 파열이 축소되므로 날카로운 마이크로 전극을 사용할 때 HN 또는 다른 뉴런의 주의 깊은 침전이 필요하다. (전체 세포 패치 기록 기술, 도입 된 누출을 최소화, 또한 다른 뉴런에 적용 할 수 있습니다,하지만 거머리 뉴런에 잘 작동하지 않습니다.) HN 뉴런의 침전은 뉴런에 최소한의 손상을 야기하는 것이 중요하며(추가 누출), 입력 저항을 모니터링해야 하며 성공적인 실험을 위해 60-100 MOhms의 범위에 있어야 한다4.
동적 클램프는 강력한 기술이지만, 인공 전도도가 기록 전극의 현장에서 구현되기 때문에 신경 형상에 의해 부과되는 한계가 있는데, 이는 일반적으로 리듬 생성전류가 보통 국한된 부위에 있는 세포 체체가5,6,10이다. 거머리 HN 뉴런에서, 세포 체는 대부분의 활성 전류가 국소화되는 뉴런의 통합 영역 (main neurite)에 전기적으로 가깝고 스파이크가 시작됩니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그들의 파열 능력을 입증 HN (7) 뉴런에 예비 동적 클램프 실험크리스티안 Erxleben 감사합니다. 안젤라 베닝은 전문가의 조언으로 실험을 도왔다. 우리는 GSC와 RLC에 그랜트 1 R21 NS11355를 통해이 작업에 자금을 NIH를 인정합니다.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |