Summary

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

Published: June 12, 2020
doi:

Summary

هنا ، نحن وصف طريقة للاحترار البلاستوسيستات البشرية vitrified ، وزراعة لهم من خلال فترة زرع في المختبر ، وهضمها في خلايا واحدة وجمع الخلايا الأرومية في وقت مبكر لمزيد من التحقيق.

Abstract

زرع الإنسان، والرضا والالتصاق على سطح الرحم epithelia والغزو اللاحق للبلاستيس في decidua الأم، هو حدث البيولوجية الحرجة ولكن ملغز التي كانت تاريخيا صعوبة في الدراسة بسبب القيود التقنية والأخلاقية. يتم البدء في عملية الزرع عن طريق تطوير التروبكتوميرم إلى الأرومية المبكرة والتمايز اللاحق إلى خطوط فرعية متمايزة. قد يؤدي التمايز التروبيبلاستي المبكر المُنحرف إلى فشل الزرع وأمراض المشيمة وتشوهات الجنين والإجهاض. وقد تم مؤخراً تطوير طرق تسمح للأجنة البشرية بالنمو حتى اليوم الثالث عشر بعد الإخصاب في المختبر في غياب أنسجة الأمومة، وهي فترة زمنية تشمل فترة الزرع في البشر. وقد أعطى هذا الباحثين الفرصة للتحقيق في زرع الإنسان واختصار ديناميات التمايز trophoblast خلال هذه الفترة الحرجة دون الخلط بين التأثيرات الأم وتجنب العقبات الكامنة في دراسة الأحداث المبكرة لتمايز الأجنة في الجسم الحي. لتوصيف مختلف الطانيف الفرعية trophoblast أثناء الزرع، اعتمدنا القائمة ثنائية الأبعاد (2D) أساليب الثقافة الموسعة ووضعنا إجراء لهضم وعزل الأنزيمية أنواع مختلفة من الخلايا trophoblast لمقايسات المصب. الأجنة المستزرعة في ظروف ثنائية الأبعاد لديها مورفولوجيا مسطّحة نسبيًا وقد تكون دون المستوى الأمثل في النمذجة في العمارات الجنينية ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. ومع ذلك، يبدو أن التمايز الأرومية أقل تأثرا كما يتضح من التغيرات المتوقعة في المورفولوجيا والتعبير الجيني على مدى الثقافة الممتدة. يمكن فصل مختلف التوروفوبلاست sublineageages، بما في ذلك cytotrophoblast، syncytiotrophoblast وتوروفوبلاست المهاجرة حسب الحجم، والموقع، والظهور الزمني، واستخدامها لمزيد من التوصيف أو التجريب. قد يكون فحص هذه الخلايا الأرومية المبكرة مفيدًا في فهم زرع الإنسان ، وعلاج أمراض المشيمة الشائعة ، وتخفيف حدوث فقدان الحمل.

Introduction

من الصعب تاريخياً التحقيق في زرع الإنسان وظهور المشيمة المبكرة ولا يزالان مجهولين إلى حد كبير لأن الأنسجة البشرية لا يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التي لا يمكن فيها اكتشاف الحمل سريرياً. النماذج الحيوانية غير كافية، حيث أن المشيمة البشرية لها ميزاتها الفريدة مقارنة بالثدييات الأوروبية الأخرى. على سبيل المثال ، تغزو المشيمة البشرية بعمق في decidua مع بعض الخلايا الأرومية التي تصل على الأقل إلى الثلث الداخلي من ميوميتوميوم الرحم بينما تعيد الخلايا الأخرى تشكيل الشرايين الحلزونية الرحمية. حتى أسلافنا التطورية الأقرب، الرئيسيات غير البشرية، تظهر الاختلافات في مورفولوجيا المشيمة والتفاعلات الأرومية مع الأنسجة الوَرَقِية الأمومية1،2،3. الحصول على ما قبل زرع الأجنة البشرية في المختبر لم يكن ممكنا حتى في عام 1980 عندما بدأ الإخصاب البشري السريري في المختبر (IVF) كممارسة روتينية لعلاج العقم4. الآن، يمكن زراعة الكيسات البشرية في المختبر للسماح باختيار أجنة أكثر قابلية للحياة لنقلها، فضلا عن تمكين الاختبارات الجينية الآمنة. وقد أدى التحسن في تقنيات زراعة الأجنة، فضلا عن زيادة استخدام التلقيح الاصطناعي العديد من البلاستوسيستات الفائضة التي لا تزال بعد الانتهاء من دورات علاج المريض. مع موافقة المريض، موافقة IRB، ومع بعض القيود، يمكن استخدام هذه البلاستوسيست للدراسات البحثية. لقد أصبحت موردا لا يقدر بثمن التي كانت تستخدم لاشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية5, فهم انتقال كتلة الخلايا الداخلية إلى الخلايا الجذعية الجنينية6,7, ومؤخرا, وقد تم استزراع بنجاح حتى يوم (D) 13 لإعادة تشكيل زرع الإنسان8,9. من خلال الاستفادة من النهج التي وضعت مؤخرا أوميكس خلية واحدة، والوصول إلى هذه الزرع في مرحلة أنسجة الأجنة البشرية قد عرضت فرصا فريدة لوصف الآليات الجزيئية التي تنظم هذه العملية تمايز الخلايا ديناميكية للغاية، والتي كان من المستحيل في السابق لاستكشاف10،11،12،13.

هنا، نحن وصف الأساليب المستخدمة في نشرتنا الأخيرة التي تميز ديناميات التمايز trophoblast أثناء زرع الإنسان12. ويشمل هذا البروتوكول ارتفاع درجة حرارة الخلايا البلاستية vitrified، وتربية الجنين الموسعة تصل إلى D12 بعد التلقيح الاصطناعي، والهضم الأنزيمي للجنين في خلايا واحدة، وجمع الخلايا للمصب المقايسات(الشكل 1). هذا النظام ثقافة موسعة تدعم مرحلة ما قبل زرع تطور الجنين البشري دون مدخلات الأم وتلخص التمايز trophoblast التي تظهر متسقة مع الملاحظات التي أجريت من العينات النسيجية منذ سنوات عديدة14,15,16,17. أثناء الزرع، يتكون عدد الخلايا الدودة التورفوبلاستية من نوعين على الأقل من الخلايا: الخلايا ذات الأصل الأحادي النوى الشبيهة بالسيلوتروبوفبلاست (CTB) والـ متزامنة متعددة النوى (STB) متمايزة بشكل ميؤوس من شفائها. عند هضم التربسين ، فإن CTB هي خلايا صغيرة مستديرة لا يمكن تمييزها بشكل مورفولوجي عن أنساب الخلايا الأخرى (الشكل 2A، اللوحة اليسرى). فصل CTB من أنساب الخلايا الأخرى، مثل الغموض و endoderm البدائية، يمكن تحقيقه من خلال ملفاتهم الشخصية المستنسخة المتميزة التي كشفت عنها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يمكن التعرف بسهولة على خلايا Syncytiotrophoblast على أنها هياكل غير منتظمة الشكل أكبر بكثير من أنواع الخلايا الأخرى وتقع بشكل رئيسي في محيط الجنين(الشكل 2A، اللوحة الوسطى ؛ الشكل 2B، لوحة اليسار). الخلايا التروبيبلاستية المهاجرة (MTB) هي آخر الترومبوست sublineage وجدت خلال نموت الجنين وتمدد ويمكن التعرف على أنها تتحرك على ما يبدو بعيدا عن الجسم الرئيسي للجنين(الشكل 2A، لوحة الحق ، الشكل 2B، لوحة الحق). الترود الأروميست المهاجر ، على الرغم من التعبير عن العديد من العلامات نفسها مثل trophoblast (EVT) ، لا ينبغي أن يشار إليه باسم EVT ، لأن الهياكل التافهة في المشيمة لم تظهر في هذه المرحلة المبكرة من التطور.

تجريبيا، كنا قادرين على جمع CTB صغيرة وكبيرة STB التي يمكن تمييزها بسهولة بعد يتم هضم الأجنة في خلايا واحدة في D8، D10، وD12(الشكل 2A، B). تنشأ التروبيبلاستات المهاجرة في المراحل اللاحقة من زراعة الجنين الممتدة ويمكن جمعها عند D12 قبل الهضم الأنزيمي للجنين بأكمله(الشكل 2A, B). عن طريق فصل ظاهري هذه الثلاثة الفواصل الفرعية trophoblast قبل تحليل خلية واحدة، يمكننا تحديد علامات النسخ محددة وتحديد الدور البيولوجي لكل نوع خلية. Cytotrophoblast هي الانتشارية للغاية وتعمل كخلايا السلف في توريد STB وMTB ينساب متباينة10,11,12,13. Syncytiotrophoblast تشارك في انتاج هرمونات المشيمة للحفاظ على الحمل ، ويمكن أيضا أن تكون مسؤولة عن الأجنة التجشؤ في بطانة الرحم10،11،12،13. التربوبلاست المهاجرة لديها ميزات أقوى من النمط الظاهري الغازية، و المهاجرة ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن أعمق وأكثر اتساعا استعمار بطانة الرحم10,11,12,13. بعد تعريف التوقيع النسخي لكل نوع خلية، كشفت تحليلات التجميع أيضاً عن مجموعتين فرعيتين إضافيتين من الخلايا التي لا يمكن تمييزها بشكل مورفولوجي عن CTB وكان لها نسخ مع ميزات STB وMTB، على التوالي12. ومن المرجح أن تكون هذه الخلايا المتوسطة في مرحلة التمييز من CTB إلى المستويات الفرعية MTB أو STB، وكان سيتم تجاهلها إذا تم هضم الأجنة بشكل أعمى وفصل الخلايا عن طريق النسخ وحدها.

يستخدم البروتوكول الموصوف هنا نظام ثقافة ثنائي الأبعاد (2D) وقد لا يكون الأمثل لدعم التنمية الهيكلية ثلاثية الأبعاد ( 3D ) ، كما اقترح منشور حديث يصف نظام ثقافة ثلاثية الأبعاد تم تطويره حديثًا13. ومع ذلك، في هذا النظام 2D التمايز من trophoblast في وقت مبكر يبدو أن تتفق مع الملاحظات التي أجريت من العينات في vivo14،15،16،17. ويمكن أيضا أن يكون هذا البروتوكول بسهولة تكييفها للاستخدام في نظام الثقافة 3D وصفها مؤخرا13 مع الحد الأدنى من التغييرات. يتم تنفيذ جميع الخطوات مع ماصة micromanipulation المحمولة مع نصائح المتاح تجاريا المتاح أو ماصة الفم من ماصة الزجاج سحبت ناعما تعلق على أنابيب المطاط، وتصفية، وبوق.

Protocol

وقد تم التبرع بجميع الأجنة البشرية بموافقة لاستخدامها في البحوث. وقد وافق المجلس الغربي لمراجعة المؤسسات (دراسة رقم 1179872) على بروتوكولات لثقافة الأجنة البشرية الموسعة، وتتبع المبادئ التوجيهية الدولية. يجب مراجعة أي استخدام للأجنة البشرية من قبل الأخلاقيات المناسبة ومجالس الإدارة المرتب…

Representative Results

أظهرت الأجنة السليمة استمرار انتشارها على مدى انتشارها(الشكل 2B). بدأت الأجنة غير الطبيعية في التراجع عن حوافها الخارجية وتتفكك (الشكل 2C). من تجربتنا، تم إرفاق ما يقرب من 75٪ من الأجنة إلى الجزء السفلي من طبق ليفي المغلفة في 48 ساعة، وزاد المرفق إلى ما يقرب من 90?…

Discussion

وقد سمح تطوير بروتوكول لزراعة الأجنة البشرية من خلال زرع العلماء لاستكشاف وقت مجهول سابقا في التنمية8,9. هنا، نستخدم نظام ثقافة ممتد لثقافة الأجنة البشرية وندرس التمايز الأرومية المبكر قبل تشكيل المشيمة الزهية. تسمح لنا الطرق الموصوفة هنا بجمع خطوط فرعية م?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نعترف بالعديد من المرضى في مركز كولورادو للطب التناسلي (CCRM) الذين تبرعوا بكرم أجنةهم للأبحاث. نود أيضا أن نشكر كارين Maruniak والمختبر السريري في CCRM لمساعدتهم في معالجة عينات hCG، وكذلك سو ماكورميك وفريقها السريري IVF علم الأجنة في CCRM لمساعدتهم في جمع الأجنة، وتخزين، وتتبع، وتبرع. وقد قدم التمويل داخلياً من جانب اللجنة المعنية باتفاقية مكافحة التصحر.

Materials

3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 62406-038 Case of 500
5 mL snap cap tube VWR 60819-295 Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 25382-687 Case of 200
6-well dish Agtech Inc. D18 Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution Millipore Sigma T1788 100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips VWR 76322-156 Pack of 960
Blast, blastocyst culture media Origio 83060010 10 mL
Dilution Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Thermo Fisher Scientific 1367820D 5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Millipore Sigma D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil Vitrolife 10029 100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL VWR 47730-598 Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL VWR 89130-980 Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution Millipore Sigma F0895 1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media Vitrolife 10129 125 mL
Handling media Origio 83100060 60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip Ibidi 80826 15 slides per box
IVC1/IVC2 Cell Guidance Systems M11-25/ M12-25 5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate Cooper Surgical 23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane Fisher Scientific SLGVR33RS Pack of 50
Mouth pieces IVF Store MP-001-Y 100 pieces
Oosafe center well dish Oosafe OOPW-CW05-1 Case of 500
Quinn's Advantage SPS Origio ART-3010 12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces IVF Store IVFS-NRL-B-5 5 ft.
Stereomicroscope Nikon SMZ1270
Stripper tips Cooper Surgical MXL3-275 20/pk 275 µm
Thawing Solution Kitazato VT802 2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter Cooper Surgical MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher Scientific 12604013 1 x 100 mL
Tween20 Millipore Sigma P1379-25ML 25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips VWR 76322-134 Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips VWR 89174-526 Pack of 960
Washing Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL

References

  1. Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
  2. Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
  3. Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
  4. Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  6. O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
  7. O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
  8. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  9. Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
  10. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  11. Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
  12. West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
  13. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  14. Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
  15. Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
  16. Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
  17. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
  18. Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
check_url/fr/61476?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Logsdon, D. M., Kile, R. A., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L., Yuan, Y. Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos. J. Vis. Exp. (160), e61476, doi:10.3791/61476 (2020).

View Video