Enkeltcellesamling af trophoblastceller i peri-implantationsstadium menneskelige embryoner
Summary
Her beskriver vi en metode til opvarmning af forglasificerede menneskelige blastocysts, der dyrker dem gennem implantationsperioden in vitro, fordøjer dem i enkelte celler og indsamler tidlige trophoblastceller til yderligere undersøgelse.
Abstract
Menneskelig implantation, apposition og vedhæftning til livmoderoverfladen epithelia og efterfølgende invasion af blastocyst i moderen decidua, er en kritisk endnu gådefuld biologisk begivenhed, der har været historisk vanskeligt at studere på grund af tekniske og etiske begrænsninger. Implantation er initieret ved udvikling af trophectoderm til tidlig trophoblast og efterfølgende differentiering i forskellige trophoblast underlinjer. Afvigende tidlig trophoblast differentiering kan føre til implantation fiasko, placenta patologier, føtale abnormiteter, og abort. For nylig er der udviklet metoder til at tillade menneskelige embryoner at vokse indtil dag 13 efter befrugtning in vitro i mangel af maternel væv, en periode, der omfatter implantationsperioden hos mennesker. Dette har givet forskerne mulighed for at undersøge menneskelig implantation og opsummere dynamikken i trophoblast differentiering i denne kritiske periode uden at forvirre moderens påvirkninger og undgå iboende hindringer for at studere tidlige embryo differentiering begivenheder in vivo. For at karakterisere forskellige trophoblast-underlinjer under implantation har vi vedtaget eksisterende todimensionelle (2D) udvidede dyrkningsmetoder og udviklet en procedure til enzymatisk fordøje og isolere forskellige typer trophoblastceller til downstream-analyser. Embryoner dyrket under 2D-forhold har en relativt fladfræt morfologi og kan være suboptimale i modellering in vivo tre-dimensionelle (3D) embryonale arkitekturer. Trophoblast-differentiering synes imidlertid at være mindre påvirket, som det fremgår af forventede ændringer i morfologien og genekspressionen i løbet af den udvidede kultur. Forskellige trophoblast underlinjer, herunder cytotrophoblast, syncytiotrophoblast og vandrende trophoblast kan adskilles efter størrelse, placering, og tidsmæssige fremkomst, og bruges til yderligere karakterisering eller eksperimenter. Undersøgelse af disse tidlige trophoblast celler kan være medvirkende til at forstå menneskelig implantation, behandling af fælles placenta patologier, og afbøde forekomsten af graviditet tab.
Introduction
Human implantation og fremkomsten af den tidlige moderkagen er historisk vanskelige at undersøge og forbliver stort set ukendt, fordi humane væv er utilgængelige på dette tidspunkt, hvor graviditet er klinisk målbart. Dyremodeller er utilstrækkelige, da menneskelig placentisering har sine egne unikke egenskaber i forhold til andre euteriske pattedyr. For eksempel, menneskelige placenta invaderer dybt ind i decidua med nogle trophoblast celler nå mindst den indre tredjedel af livmoderen myometrium, mens andre celler omforme livmoderen spiral arterier. Selv vores nærmeste evolutionære forfædre, de ikke-menneskelige primater, viser forskelle i placenta morfologi og trophoblast interaktioner med moderensafgørende væv 1,,2,,3. Opnåelse af præimplantatation menneskelige embryoner in vitro var ikke muligt, før i 1980’erne, da klinisk human in vitro befrugtning (IVF) startede som en rutinemæssig praksis til behandling af infertilitet4. Nu kan menneskelige blastocyster dyrkes in vitro for at give mulighed for udvælgelse af mere levedygtige embryoner til overførsel, samt muliggøre sikker genetisk testning. Forbedring i embryo kultur teknikker, samt den stigende brug af IVF har givet mange overskydende blastocyster, som forbliver efter patientens behandling cykler er afsluttet. Med patientens samtykke, IRB godkendelse, og med visse restriktioner, disse blastocysts kan anvendes til forskningsundersøgelser. De er blevet en uvurderligressource,der blev brugt til afledning af menneskelige embryonale stamceller5, forståelse af overgangen af indre cellemasse til embryonale stamceller6,7, ogfor nylig, er blevet med succes dyrket indtil dag (D) 13 til remodel human implantation8,9. Ved at udnytte nyligt udviklede enkeltcelleomics tilgange, adgang til disse implantation fase menneskelige embryo væv har tilbudt unikke muligheder for at beskrive de molekylære mekanismer, der regulerer denne meget dynamisk celle differentiering proces, som tidligere var umuligt atudforske 10,11,12,13.
Her beskriver vi de metoder, der anvendes i vores seneste publikation, der karakteriserer dynamikken i trophoblast differentiering under menneskelig implantation12. Denne protokol omfatter opvarmning af forglasset blastocyster, udvidet embryokultur op til D12 post IVF, enzymatisk nedbrydning af embryonet i enkelte celler og celleindsamling til downstream-analyser (figur 1). Dette udvidede kultursystem understøtter peri-implantation fase menneskelige embryo udvikling uden moderens input og opsummerer trophoblast differentiering, der synes i overensstemmelse med observationer fra histologiske prøver mange årsiden 14,15,16,17. Under implantationen består trofoblastpopulationen af mindst to celletyper: den mononukleerede progenitorlignende cytotrophoblast (CTB) og den terminalt differentierede, flerkernede syncytiotrophoblast (STB). Ved trypsin fordøjelse, CTB er små, runde celler, der er morfologisk umulig at skelne fra andre celle slægter(Figur 2A,venstre panel). Adskillelse af CTB fra andre celle slægter, såsom epiblast og primitive endoderm, kan opnås ved deres særskilte transskriptive profiler afsløret ved enkeltcelle RNA sekventering. Syncytiotrophoblast celler kan let identificeres som uregelmæssige formede strukturer, der er betydeligt større end de andre celletyper og hovedsagelig placeret i periferien af fosteret (Figur 2A, midterste panel; Figur 2B, venstre panel). Migrerende trophoblast celler (MTB) er en anden trophoblast underlinje findes under embryo udvidet kultur og kan anerkendes som tilsyneladende bevæger sig væk fra hoveddelen af fosteret (Figur 2A, højre panel, Figur 2B, højre panel). Migrationstrophoblast bør, selv om den udtrykker mange af de samme markører som ekstra villous trophoblast (EVT), ikke betegnes som evt, da de villous strukturer i moderkagen ikke er opstået på dette meget tidlige udviklingsstadyd.
Eksperimentelt, vi var i stand til at indsamle små CTB og store STB, der er let skelnes efter embryoner er fordøjet i enkelte celler på D8, D10, og D12 (Figur 2A, B). Træktrophoblaster opstår på de senere stadier af den udvidede embryokultur og kan indsamles i D12, før hele fosterets enzymatiske fordøjelse (figur 2A,B). Ved fænopypisk at adskille disse tre trophoblast-underlinjer før enkeltcelleanalyse kan vi identificere specifikke transskriptionomiske markører og definere den biologiske rolle for hver celletype. Cytotrophoblast er meget proliferative og fungerer som progenitor celler i at levere STB og MTB differentieret slægter10,11,12,13. Syncytiotrophoblast er involveret i produktionen af placentahormoner for at opretholde graviditeten og kan også være ansvarlig for embryoner gravende ind i endometrium10,,11,,12,13. Vandrende trophoblast har endnu stærkere træk ved en invasiv, vandrende fænotype og er sandsynligvis ansvarlig for dybere og mere omfattende kolonisering af livmoderen endometrium10,11,12,13. Efter at have defineret den transskriptiske signatur for hver celletype har klyngeanalyser også afsløret yderligere to undergrupper af celler, der var morfologisk umulig at skelne fra CTB og havde transkriptiker med funktioner i STB og MTB,henholdsvis 12. Disse mellemliggende fase celler er sandsynligvis i færd med at differentiere fra CTB til enten MTB eller STB underlinjer og ville have været overset, hvis embryoner var blindt fordøjet og celler blev adskilt af transcriptome alene.
Den protokol, der er beskrevet her, anvender et todimensionelt (2D) kultursystem og er muligvis ikke optimal til at understøtte den tredimensionale (3D) strukturelle udvikling, som foreslået af en nylig publikation, der beskriver et nyudviklet 3D-kultursystem13. Ikke desto mindre synes differentieringen af tidlig trophoblast i dette 2D-system at være i overensstemmelse med observationer foretaget af in vivo-prøverne14,15,16,17. Denne protokol kan også let tilpasses til brug i det nyligt beskrevne 3D-kultursystem13 med minimale ændringer. Alle trin udføres med en håndholdt mikromanipulationpipette med kommercielt tilgængelige engangsspidser eller en mundpipette fra en finttrukket glaspipette fastgjort til gummislanger, et filter og et mundstykke.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af protokollen til kultur menneskelige embryoner gennem implantation har gjort det muligt for forskere at udforske en tidligere ukendt tid i udvikling8,9. Her bruger vi et udvidet kultursystem til at dyrke menneskelige embryoner og studere tidlig trophoblast differentiering før dannelsen af villous placenta. De metoder, der er beskrevet her, giver os mulighed for at indsamle forskellige TB-underlinjer til brug i downstream-enkeltcelleanalyse. Dette a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende de mange patienter på Colorado Center for Reproduktiv Medicin (CCRM), der har allernådigst doneret deres embryoner til forskning. Vi vil også gerne takke Karen Maruniak og det kliniske laboratorium på CCRM for deres hjælp til behandling af hCG prøver, samt Sue McCormick og hendes kliniske IVF embryologi team på CCRM for deres hjælp med embryo indsamling, opbevaring, sporing og donation. Finansieringen blev ydet internt af CCRM.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
