Summary

Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

Published: June 12, 2020
doi:

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour réchauffer les blastocystes humains vitrifiés, les cultiver à travers la période d’implantation in vitro, les digérer en cellules individuelles et recueillir les cellules trophoblastiques précoces pour une étude plus approfondie.

Abstract

L’implantation humaine, l’apposition et l’adhérence à l’épithélie de surface utérine et l’invasion subséquente du blastocyste dans le decidua maternel, est un événement biologique critique mais énigmatique qui a été historiquement difficile à étudier en raison de limitations techniques et éthiques. L’implantation est initiée par le développement du trophectoderme au trophoblaste précoce et la différenciation ultérieure en sous-lignées trophoblastiques distinctes. La différenciation précoce aberrante de trophoblast peut mener à l’échec d’implantation, aux pathologies placentaires, aux anomalies foetales, et à la fausse couche. Récemment, des méthodes ont été développées pour permettre aux embryons humains de se développer jusqu’au jour 13 après la fécondation in vitro en l’absence de tissus maternels, une période qui englobe la période d’implantation chez l’homme. Cela a donné aux chercheurs l’occasion d’étudier l’implantation humaine et de récapituler la dynamique de la différenciation des trophoblastes au cours de cette période critique sans confondre les influences maternelles et éviter les obstacles inhérents à l’étude des événements précoces de différenciation des embryons in vivo. Pour caractériser différents sous-lignes trophoblastiques lors de l’implantation, nous avons adopté des méthodes de culture étendue bidimensionnelles (2D) existantes et développé une procédure pour digérer et isoler enzymatiquement différents types de cellules trophoblastiques pour les tests en aval. Les embryons cultivés dans des conditions 2D ont une morphologie relativement aplatie et peuvent être sous-optimaux dans la modélisation in vivo en trois dimensions (3D) architectures embryonnaires. Cependant, la différenciation des trophoblastes semble être moins affectée, comme en témoignent les changements prévus de morphologie et d’expression génique au cours de la culture étendue. Différents sous-lignes trophoblastiques, y compris le cytotrophoblaste, le syncytiotrophoblaste et le trophoblaste migrateur, peuvent être séparés par la taille, l’emplacement et l’émergence temporelle, et utilisés pour d’autres caractérisations ou expérimentations. L’étude de ces cellules trophoblastiques tôt peut être instrumentale dans la compréhension de l’implantation humaine, le traitement des pathologies placentaires communes, et l’atténuation de l’incidence de la perte de grossesse.

Introduction

L’implantation humaine et l’émergence du placenta précoce sont historiquement difficiles à étudier et restent largement inconnues parce que les tissus humains sont inaccessibles à ce stade où la grossesse est cliniquement indétectable. Les modèles animaux sont inadéquats, car la placentation humaine a ses propres caractéristiques uniques par rapport à d’autres mammifères euthériens. Par exemple, le placenta humain envahit profondément dans la decidua avec quelques cellules trophoblastiques atteignant au moins le tiers intérieur du myomètre utérin tandis que d’autres cellules remodelent les artères spirales utérines. Même nos ancêtres évolutionnaires les plus proches, les primates non humains, montrent des différences dans la morphologie placentaire et les interactions trophoblastiques avec les tissus décennals maternels1,2,3. L’obtention d’embryons humains préimplantation in vitro n’a été possible que dans les années 1980, lorsque la fécondation in vitro humaine clinique (FIV) a commencé comme une pratique courante pour le traitement de l’infertilité4. Maintenant, les blastocystes humains peuvent être cultivés in vitro pour permettre la sélection d’embryons plus viables pour le transfert, ainsi que permettre des tests génétiques sûrs. L’amélioration des techniques de culture d’embryon, ainsi que l’utilisation croissante de la FIV a donné lieu à de nombreux blastocystes excédentaires qui restent après les cycles de traitement du patient ont été achevés. Avec le consentement du patient, l’approbation de la CISR et certaines restrictions, ces blastocystes peuvent être utilisés pour des études de recherche. Ils sont devenus une ressource inestimable qui ont été utilisés pour la dérivation des cellules souches embryonnaires humaines5, comprendre la transition de la masse cellulaire interne aux cellules souches embryonnaires6,7, et plus récemment, ont été cultivés avec succès jusqu’au jour (D) 13 pour remodeler l’implantation humaine8,9. En utilisant des approches omiques unicellulaires récemment développées, l’accès à ces tissus embryonnaires humains au stade d’implantation a offert des occasions uniques de décrire les mécanismes moléculaires qui régulent ce processus de différenciation cellulaire très dynamique, qui étaient auparavant impossibles à explorer10,11,12,13.

Ici, nous décrivons les méthodes utilisées dans notre publication récente caractérisant la dynamique de la différenciation trophoblastique lors de l’implantation humaine12. Ce protocole comprend le réchauffement des blastocystes vitrifiés, la culture embryonnaire étendue jusqu’à la D12 après la FIV, la digestion enzymatique de l’embryon en cellules individuelles et la collecte de cellules pour les tests en aval (figure 1). Ce système de culture étendue soutient le développement de l’embryon humain au stade péri-implantation sans apport maternel et récapitule la différenciation des trophoblastes qui semble compatible avec les observations faites à partir de spécimens histologiques il y a de nombreuses années14,15,16,17. Pendant l’implantation, la population de trophoblastes est composée d’au moins deux types de cellules : le cytotrophoblast mononucléé progéniteur(CTB) et le syncytiotrophoblaste multinucléé (STB) différencié en phase terminale. Lors de la digestion de la trypsine, le CTB sont de petites cellules rondes qui sont morphologiquement indiscernables des autres lignées cellulaires (figure 2A, panneau gauche). La séparation de CTB d’autres lignées cellulaires, telles que l’épiblaste et l’endoderme primitif, peut être réalisée par leurs profils transcriptomiques distincts révélés par séquençage de l’ARN unicellulaire. Les cellules syncytiotrophoblastiques peuvent être facilement identifiées comme des structures de forme irrégulière qui sont significativement plus grandes que les autres types de cellules et principalement situées à la périphérie de l’embryon (figure 2A, panneau intermédiaire; Figure 2B, panneau gauche). Les cellules trophoblastiques migratrices (TMB) sont un autre sous-lignée trophoblastique trouvée au cours de la culture élargie de l’embryon et peuvent être reconnues comme s’éloignant apparemment du corps principal de l’embryon (Figure 2A, panneau droit, figure 2B, panneau droit). Le trophoblaste migrateur, bien qu’exprimant beaucoup des mêmes marqueurs que le trophoblaste villous supplémentaire (EVT), ne devrait pas être appelé EVT, puisque les structures de villous dans le placenta n’ont pas émergé à ce stade très tôt de développement.

Expérimentalement, nous avons pu recueillir de petits CTB et de grands STB qui se distinguent facilement après que les embryons sont digérés en cellules simples à D8, D10 et D12 (Figure 2A,B). Les trophoblastes migrateurs apparaissent aux stades ultérieurs de la culture embryonnaire étendue et peuvent être recueillis à D12 avant la digestion enzymatique de l’embryon entier (Figure 2A,B). En séparant phénotypiquement ces trois sous-lignes trophoblastiques avant l’analyse des cellules uniques, nous pouvons identifier des marqueurs transcriptomiques spécifiques et définir le rôle biologique de chaque type de cellule. Cytotrophoblast sont très prolifératifs et agissent comme des cellules progénitrices dans l’approvisionnement des lignées différenciées STB et VTT10,11,12,13. Syncytiotrophoblast sont impliqués dans la production d’hormones placentaires pour maintenir la grossesse et peuvent également être responsables des embryons enfouis dans l’endomètre10,11,12,13. Le trophoblaste migrateur présente des caractéristiques encore plus fortes d’un phénotype migrateur envahissant et est probablement responsable d’une colonisation plus profonde et plus étendue de l’endomètre utérin10,11,12,13. Après avoir défini la signature transcriptomique de chaque type de cellule, les analyses de regroupement ont également révélé deux sous-ensembles supplémentaires de cellules qui étaient morphologiquement indiscernables de CTB et avaient des transcriptomes avec des caractéristiques de STB et MTB, respectivement12. Ces cellules intermédiaires sont probablement en train de différencier de CTB aux sous-lignes MTB ou STB et auraient été négligées si les embryons avaient été digérés aveuglément et si les cellules avaient été séparées par le transcriptome seulement.

Le protocole décrit ici utilise un système de culture bidimensionnel (2D) et peut ne pas être optimal pour soutenir le développement structurel tridimensionnel (3D), comme suggéré par une publication récente décrivant un système de culture 3D nouvellement développé13. Néanmoins, dans ce système 2D, la différenciation du trophoblaste précoce semble être compatible avec les observations faites à partir de spécimens in vivo14,15,16,17. Ce protocole peut également être facilement adapté pour l’utilisation dans le système de culture 3D récemment décrit13 avec des changements minimes. Toutes les étapes sont effectuées avec une pipette de micromanipulation de poche avec des pointes jetables disponibles dans le commerce ou une pipette buccale d’une pipette en verre finement tirée attachée à des tubes en caoutchouc, un filtre et un embout buccal.

Protocol

Tous les embryons humains ont été donnés avec le consentement pour une utilisation dans la recherche. Les protocoles relatifs à la culture élargie des embryons humains ont été approuvés par la Commission d’examen institutionnel de l’Ouest (étude no 1179872) et suivent les lignes directrices internationales. Toute utilisation d’embryons humains doit être examinée par les organes d’éthique et de gouvernance appropriés associés à l’établissement de recherche à l’aide de ce protocole. <p clas…

Representative Results

Les embryons sains ont fait l’présentant une prolifération continue au cours de la culture étendue (Figure 2B). Les embryons anormaux ont commencé à se rétracter de leurs bords extérieurs et à se désintégrer (figure 2C). D’après notre expérience, environ 75% des embryons ont été attachés au fond du plat enduit de fibronectine à 48 h et l’attachement a augmenté à environ 90% par 72 h en culture. Le succès de l’attachement à l’embryon…

Discussion

Le développement du protocole de culture des embryons humains par l’implantation a permis aux scientifiques d’explorer une période inédite dans le développement8,9. Ici, nous utilisons un système de culture étendu pour la culture des embryons humains et étudier la différenciation des trophoblastes précoces avant la formation du placenta villous. Les méthodes décrites ici nous permettent de collecter différents sous-lignes de tuberculose pour une u…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier les nombreux patients du Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) qui ont gracieusement fait don de leurs embryons pour la recherche. Nous tenons également à remercier Karen Maruniak et le laboratoire clinique du CCRM pour leur aide dans le traitement des échantillons de hCG, ainsi que Sue McCormick et son équipe d’embryologie clinique de FIV au CCRM pour leur aide à la collecte, au stockage, au suivi et au don d’embryons. Le financement a été fourni à l’interne par le CCRM.

Materials

3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 62406-038 Case of 500
5 mL snap cap tube VWR 60819-295 Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish VWR 25382-687 Case of 200
6-well dish Agtech Inc. D18 Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution Millipore Sigma T1788 100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips VWR 76322-156 Pack of 960
Blast, blastocyst culture media Origio 83060010 10 mL
Dilution Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets Thermo Fisher Scientific 1367820D 5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Millipore Sigma D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil Vitrolife 10029 100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL VWR 47730-598 Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL VWR 89130-980 Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution Millipore Sigma F0895 1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman Thermo Fisher Scientific F123602G 1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media Vitrolife 10129 125 mL
Handling media Origio 83100060 60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip Ibidi 80826 15 slides per box
IVC1/IVC2 Cell Guidance Systems M11-25/ M12-25 5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate Cooper Surgical 23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane Fisher Scientific SLGVR33RS Pack of 50
Mouth pieces IVF Store MP-001-Y 100 pieces
Oosafe center well dish Oosafe OOPW-CW05-1 Case of 500
Quinn's Advantage SPS Origio ART-3010 12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces IVF Store IVFS-NRL-B-5 5 ft.
Stereomicroscope Nikon SMZ1270
Stripper tips Cooper Surgical MXL3-275 20/pk 275 µm
Thawing Solution Kitazato VT802 2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter Cooper Surgical MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher Scientific 12604013 1 x 100 mL
Tween20 Millipore Sigma P1379-25ML 25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips VWR 76322-134 Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips VWR 89174-526 Pack of 960
Washing Solution Kitazato VT802 1 x 4 mL

References

  1. Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
  2. Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
  3. Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
  4. Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  6. O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
  7. O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
  8. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  9. Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
  10. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  11. Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
  12. West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
  13. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  14. Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
  15. Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
  16. Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
  17. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
  18. Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
check_url/fr/61476?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Logsdon, D. M., Kile, R. A., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L., Yuan, Y. Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos. J. Vis. Exp. (160), e61476, doi:10.3791/61476 (2020).

View Video