Einzelzellsammlung von Trophoblastenzellen im Peri-Implantationsstadium menschliche Embryonen
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.
Abstract
Die menschliche Implantation, die Apposition und Haftung an der Gebärmutteroberflächenepithelie und die anschließende Invasion der Blastozyste in die mütterliche Dekliste, ist ein kritisches, aber rätselhaftes biologisches Ereignis, das aufgrund technischer und ethischer Einschränkungen historisch schwierig zu untersuchen war. Die Implantation wird durch die Entwicklung des Trophektoderms zu frühen Trophoblasten und die anschließende Differenzierung in unterschiedliche Trophoblasten-Unterlinien eingeleitet. Aberrante frühe Trophoblastendifferenzierung kann zu Implantationsversagen, Plazentapathologien, fetalen Anomalien und Fehlgeburten führen. Kürzlich wurden Methoden entwickelt, die es menschlichen Embryonen ermöglichen, bis zum Tag 13 nach der Befruchtung in vitro in Abwesenheit von mütterlichem Gewebe zu wachsen, eine Zeit, die die Implantationszeit beim Menschen umfasst. Dies hat den Forschern die Möglichkeit gegeben, die menschliche Implantation zu untersuchen und die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während dieser kritischen Periode zu rekapitulieren, ohne mütterliche Einflüsse zu verwirren und inhärente Hindernisse zu vermeiden, um frühe Embryodifferenzierungsereignisse in vivo zu untersuchen. Um verschiedene Trophoblast-Unterlinien während der Implantation zu charakterisieren, haben wir bestehende zweidimensionale (2D) erweiterte Kulturmethoden übernommen und ein Verfahren entwickelt, um verschiedene Arten von Trophoblastenzellen für nachgeschaltete Assays enzymatisch zu verdauen und zu isolieren. Embryonen, die in 2D-Bedingungen kultiviert werden, haben eine relativ abgeflachte Morphologie und können suboptimal bei der Modellierung dreidimensionaler (3D) embryonaler Architekturen in vivo sein. Die Trophoblastendifferenzierung scheint jedoch weniger betroffen zu sein, wie die erwarteten Veränderungen der Morphologie und der Genexpression im Laufe der erweiterten Kultur zeigen. Verschiedene Trophoblast-Unterlinien, einschließlich Cytotrophoblast, Synzytiotrophoblast und migratorischer Trophoblasten, können durch Größe, Position und zeitliche Entstehung getrennt und für weitere Charakterisierungen oder Experimente verwendet werden. Die Untersuchung dieser frühen Trophoblastenzellen kann entscheidend zum Verständnis der menschlichen Implantation, zur Behandlung von häufigen Plazentapathologien und zur Milderung der Inzidenz von Schwangerschaftsverlusten beitragen.
Introduction
Die menschliche Implantation und die Entstehung der frühen Plazenta sind historisch schwer zu untersuchen und bleiben weitgehend unbekannt, da menschliche Gewebe in diesem Stadium, in dem eine Schwangerschaft klinisch nicht nachweisbar ist, unzugänglich sind. Tiermodelle sind unzureichend, da die menschliche Platierweise ihre eigenen Einzigartigen im Vergleich zu anderen eutherischen Säugetieren hat. Zum Beispiel dringt die menschliche Plazenta tief in die Dezidua ein, wobei einige Trophoblastenzellen mindestens das innere Drittel des Uterusmyometriums erreichen, während andere Zellen die Gebärmutterspiralarterien umgestalten. Selbst unsere nächsten evolutionären Vorfahren, die nichtmenschlichen Primaten, zeigen Unterschiede in der plazentatren Morphologie und trophoblastischen Wechselwirkungen mit den mütterlichen deziduellen Geweben1,2,3. Die Beschaffung von vorderimplantationen menschlichen Embryonen in vitro war erst in den 1980er Jahren möglich, als die klinische menschliche In-vitro-Fertilisation (IVF) als Routinepraxis zur Behandlung von Unfruchtbarkeit begann4. Jetzt können menschliche Blastozysten in vitro angebaut werden, um die Auswahl lebensfähigerer Embryonen für den Transfer zu ermöglichen und sichere genetische Tests zu ermöglichen. Die Verbesserung der Embryokulturtechniken sowie der zunehmende Einsatz von IVF haben zu vielen überschüssigen Blastozysten geführt, die nach Abschluss der Behandlungszyklen des Patienten erhalten geblieben sind. Mit Zustimmung des Patienten, IRB-Zulassung, und mit bestimmten Einschränkungen, Diese Blastozysten können für Forschungsstudien verwendet werden. Sie sind zu einer unschätzbaren Ressource geworden, die für die Ableitung menschlicher embryonaler Stammzellen verwendet wurde5, das Verständnis des Übergangs der inneren Zellmasse zu embryonalen Stammzellen6,7, und in jüngerer Zeit, wurden erfolgreich bis zum Tag (D) 13 kultiviert, um die menschliche Implantationumzugestalten 8,9. Durch die Verwendung von kürzlich entwickelten einzelzelligen Omics-Ansätzen bietet der Zugang zu diesen implantationsphase menschlichen Embryogeweben einzigartige Möglichkeiten, die molekularen Mechanismen zu beschreiben, die diesen hochdynamischen Zelldifferenzierungsprozess regulieren, die bisher unmöglich zu erforschen waren10,11,12,13.
Hier beschreiben wir die Methoden, die in unserer jüngsten Publikation verwendet werden, die die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während der menschlichen Implantation12charakterisiert. Dieses Protokoll umfasst die Erwärmung verglaster Blastozysten, die erweiterte Embryokultur bis D12 nach DerIVF, die enzymatische Verdauung des Embryos in einzelne Zellen und die Zellentnahme für nachgeschaltete Assays (Abbildung 1). Dieses erweiterte Kultursystem unterstützt die Entwicklung des peri-implantationsstadiums menschlicher Embryonen ohne mütterlichen Input und rekapituliert die Trophoblastendifferenzierung, die mit den Beobachtungen aus histologischen Proben vor vielen Jahrenübereinstimmt 14,15,16,17. Während der Implantation besteht die Trophoblastenpopulation aus mindestens zwei Zelltypen: dem mononukleierten Vorläufer-ähnlichen Zytotrophoblasten (CTB) und dem endlos differenzierten, multinukleierten Synzytiotrophoblast (STB). Bei der Trypsinverdauung sind die CTB kleine, runde Zellen, die morphologisch nicht von anderen Zelllinien zu unterscheiden sind(Abbildung 2A, linkes Panel). Die Trennung von CTB von anderen Zelllinien, wie Epiblast und primitivem Endoderm, kann durch ihre unterschiedlichen transkriptomischen Profile erreicht werden, die durch einzellige RNA-Sequenzierung aufgedeckt werden. Syncytiotrophoblast-Zellen können leicht als unregelmäßig geformte Strukturen identifiziert werden, die deutlich größer als die anderen Zelltypen sind und sich hauptsächlich an der Peripherie des Embryos befinden(Abbildung 2A, mittleres Panel; Abbildung 2B, linkes Bedienfeld). Migratory trophoblast cells (MTB) are another trophoblast sublineage found during embryo extended culture and can be recognized as apparently moving away from the main body of the embryo (Abbildung 2A, rechtes Panel, Abbildung 2B, rechtes Panel). Migrierender Trophoblast, obwohl er viele der gleichen Marker wie extra villous trophoblast (EVT) ausdrückt, sollte nicht als EVT bezeichnet werden, da die villous Strukturen in der Plazenta in diesem sehr frühen Entwicklungsstadium nicht entstanden sind.
Experimentell konnten wir kleine CTB und große STB sammeln, die leicht zu unterscheiden sind, nachdem Embryonen in einzelnen Zellen bei D8, D10 und D12 verdaut wurden (Abbildung 2A,B). Wandernde Trophoblasten entstehen in den späteren Stadien der erweiterten Embryokultur und können bei D12 vor der enzymatischen Verdauung des gesamten Embryos gesammelt werden (Abbildung 2A,B). Durch phäotypische Trennung dieser drei Trophoblasten-Unterlinien vor der Einzelzellanalyse können wir spezifische transkriptomische Marker identifizieren und die biologische Rolle jedes Zelltyps definieren. Cytotrophoblast sind hoch proliferativ und fungieren als Vorläuferzellen bei der Versorgung der STB und MTB differenzierten Linien10,11,12,13. Syncytiotrophoblast sind an der Herstellung von Plazentahormonen zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft beteiligt und können auch für die Embryonen verantwortlich sein, die sich in das Endometrium10,,11,12,13graben. Wandernder Trophoblast hat noch stärkere Merkmale eines invasiven, wandernden Phänotyps und ist wahrscheinlich für eine tiefere und umfassendere Besiedlung des Uterusendometriums10,11,12,13verantwortlich. Nach der Definition der transkriptomischen Signatur jedes Zelltyps haben Clustering-Analysen auch zwei zusätzliche Teilmengen von Zellen aufgedeckt, die morphologisch nicht von CTB zu unterscheiden waren und Transkriptome mit Merkmalen von STB und MTB bzw.12hatten. Diese Zwischenstadiumzellen sind wahrscheinlich dabei, sich von CTB auf die MTB- oder STB-Unterlinien zu differenzieren und wären übersehen worden, wenn Embryonen blind verdaut und Zellen allein durch Transkriptom getrennt worden wären.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein zweidimensionales (2D) Kultursystem und ist möglicherweise nicht optimal für die Unterstützung der dreidimensionalen (3D) strukturellen Entwicklung, wie eine kürzlich erschienene Veröffentlichung zur Beschreibung eines neu entwickelten 3D-Kultursystems13. Dennoch scheint in diesem 2D-System die Differenzierung des frühen Trophoblasten mit Beobachtungen aus in vivo Proben14,15,16,17vereinbar zu sein. Dieses Protokoll kann auch leicht für den Einsatz im kürzlich beschriebenen 3D-Kultursystem13 mit minimalen Änderungen angepasst werden. Alle Schritte werden mit einer handgeführten Mikromanipulationspipette mit handelsüblichen Einwegspitzen oder einer Mundpipette aus einer fein gezogenen Glaspipette durchgeführt, die an Gummischläuchen, einem Filter und einem Mundstück befestigt ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung des Protokolls zur Kultur menschlicher Embryonen durch Implantation hat es Wissenschaftlern ermöglicht, eine bisher unbekannte Entwicklungszeit zu erforschen8,9. Hier verwenden wir ein erweitertes Kultursystem, um menschliche Embryonen zu kultivieren und die frühe Trophoblastendifferenzierung vor der Bildung einer villous Plazenta zu untersuchen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen es uns, verschiedene TB-Unterlinien für die Nachfluss-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die vielen Patienten am Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) würdigen, die ihre Embryonen gnädig für die Forschung gespendet haben. Wir danken auch Karen Maruniak und dem klinischen Labor am CCRM für ihre Hilfe bei der Verarbeitung von hCG-Proben sowie Sue McCormick und ihrem klinischen IVF-Embryologie-Team bei CCRM für ihre Hilfe bei der Sammlung, Lagerung, Verfolgung und Spende von Embryonen. Die Finanzierung erfolgte intern durch CCRM.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
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