אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.
Abstract
השתלה אנושית, ההדבקה וההדבקה על אפיתליה פני הרחם והפלישה הבאה של blastocyst לתוך ההחלטה אימהית, הוא אירוע ביולוגי קריטי אך אניגמטי כי היה קשה מבחינה היסטורית ללמוד בשל מגבלות טכניות ואתיות. ההשתלה היא יזם על ידי הפיתוח של trophectoderm כדי trophoblast מוקדם ובדידול הבאים לתוך קווי משנה trophoblast ברורים. בידול trophoblast מוקדם חריג עלול להוביל לכשל השתלה, פתולוגיות שליה, חריגות עובר, הפלה. לאחרונה, פותחו שיטות המאפשרות לעוברים אנושיים לגדול עד היום ה-13 לאחר הפריה במבחנה בהיעדר רקמות אימהיות, פרק זמן המקיף את תקופת ההשתלה בבני אדם. זה נתן לחוקרים את ההזדמנות לחקור השתלה אנושית ולסיכום הדינמיקה של בידול trophoblast בתקופה קריטית זו מבלי לבלבל השפעות אימהיות והימנעות מכשולים טבועים ללמוד אירועי בידול העובר מוקדם ב vivo. כדי לאפיין תת-קוובלסטים שונים במהלך ההשתלה, אימצנו שיטות תרבות דו-ממדיות (דו-ממדיות) קיימות ופיתחו הליך לעיכול אנזימטי ולבודד סוגים שונים של תאי טרופוביסט לתאגידות במורד הזרם. עוברים תרבותיים בתנאים דו-ממדיים יש מורפולוגיה שטוחה יחסית עשוי להיות תת אופטימלי במידול בארכיטקטורות עובריות vivo תלת מימדי (3D). עם זאת, בידול trophoblast נראה פחות מושפע כפי שהוכח על ידי מורפולוגיה צפויה ושינויים ביטוי גנים במהלך תרבות מורחבת. קווי משנה שונים של trophoblast, כולל ציטוטרוהובלסט, סינכרון ו-trophoblast נודדים יכולים להיות מופרדים לפי גודל, מיקום והופעה זמנית, ולהשתמש בהם לאפיון נוסף או ניסויים. חקירה של תאים אלה trophoblast מוקדם עשוי להיות חיוני בהבנת השתלה אנושית, טיפול פתולוגיות שליה נפוצות, ולהקל על השכיחות של אובדן הריון.
Introduction
השתלה אנושית והוווים של שליה מוקדמת קשה מבחינה היסטורית לחקור ולהישאר ידוע במידה רבה כי רקמות אנושיות אינן נגישות בשלב זה כאשר ההריון הוא בלתי ניתן לגילוי קלינית. מודלים של בעלי חיים אינם מספקים, מכיוון של שליה אנושית יש מאפיינים ייחודיים משלה בהשוואה ליונקים אחרים. לדוגמה, שליה אנושית פולשת עמוק לתוך ההחלטה עם כמה תאים trophoblast להגיע לפחות את השלישי הפנימי של רירית הרחם בעוד תאים אחרים לאשט את העורקים ספירליים הרחם. אפילו אבותינו האבולוציוניים הקרובים ביותר, הפרימטים הלא אנושיים, מראים הבדלים במורפולוגיה שליה ובאינטראקציות טרופיות עם הרקמות המחליטותהאימהיות 1,,2,,3. קבלת עוברים אנושיים לפני ההשתלה במבחנה לא הייתה אפשרית עד בשנות ה-80 כאשר אדם קליני הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) התחיל כתרגול שגרתי לטיפולבפוריות 4. עכשיו, blastocysts אנושי יכול לגדול במבחנה כדי לאפשר את הבחירה של עוברים קיימא יותר להעברה, כמו גם לאפשר בדיקות גנטיות בטוחות. שיפור בטכניקות תרבות העובר, כמו גם את השימוש הגובר של הפריה חוץ גופית הניב blastocysts עודף רבים אשר נשאר לאחר מחזורי הטיפול של המטופל הושלמו. בהסכמת המטופל, אישור IRB, ועם הגבלות מסוימות, blastocysts אלה עשויים להיות מנוצלים למחקרים. הם הפכו למשאב יקר ערך ששימש לגירת תאי גזע עוברייםאנושיים 5, הבנת המעבר של מסת תאים פנימית לתאי גזעעובריים 6,7, ולאחרונה,כבר תרבותית בהצלחה עד היום (ד’) 13 כדי לשפץ את ההשתלההאנושית 8,9. על ידי ניצול גישות omics תא יחיד שפותחו לאחרונה, הגישה לשלב השתלה אלה רקמות העובר האנושי הציע הזדמנויות ייחודיות לתאר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את תהליך הבידול תא דינמי מאוד זה, אשר בעבר לא ניתןהיה לחקור 10,11,12,13.
כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפרסום האחרון שלנו המאפיינות את הדינמיקה של בידול trophoblast במהלך השתלהאנושית 12. פרוטוקול זה כולל את ההתחממות של blastocysts זגוגית, תרבות עובר מורחבת עד D12 לאחר הפריה חוץ גופית, עיכול אנזימטי של העובר לתאים בודדים, ואיסוף תאים עבור נתונים במורד הזרם(איור 1). מערכת תרבות מורחבת זו תומכת בשלב פרי-השתלה התפתחות העובר האנושי ללא קלט אימהי וcapitulates בידול trophoblast המופיע בקנה אחד עם תצפיות שנעשו דגימות היסטולוגיות לפנישנים רבות לפני 14,15,16,17. במהלך ההשתלה, אוכלוסיית trophoblast מורכבת לפחות משני סוגי תאים: ציטורופובלסט כמו אב מונוז’יטורופובלסט (CTB) ואת הבדיל הסופני, multinucleated syncytiotrophoblast (STB). עם עיכול trypsin, CTB הם קטנים, תאים עגולים כי הם מורפולוגית לא ניתן להבחין בין נסיונים אחרים של תאים(איור 2A,פאנל שמאלי). הפרדה של CTB מנושאים אחרים של תאים, כגון epiblast ו endoderm פרימיטיבי, ניתן להשיג על ידי פרופילים transcriptomic ברור שלהם גילה על ידי רצף RNA תא יחיד. ניתן לזהות בקלות תאים סנכרוניים כמבנים בעלי צורה לא סדירה, הגדולים משמעותית מסוגי התאים האחרים וממוקמים בעיקר בפריפריה של העובר (איור 2א,לוח אמצעי; איור 2ב’, החלונית השמאלית). תאי טרופוביסט נודדים (MTB) הם קו משנה נוסף של trophoblast שנמצא במהלך תרבות מורחבת עובר, ניתן לזהותו כמתרחק לכאורה מן הגוף הראשי של העובר(איור 2A, פאנל ימני, איור 2B,פאנל ימני). trophoblast נודד, למרות הבעת רבים של סמנים זהה כמו trophoblast villous נוסף (EVT), לא צריך להיות מכונה EVT, מאז המבנים villous שליה לא הופיע בשלב מוקדם מאוד זה של פיתוח.
מבחינה ניסיונית, הצלחנו לאסוף CTB קטן STB גדול כי הם ניתן להבחין בקלות לאחר עוברים מתעכלים לתאים בודדים ב D8, D10, ו D12 (איור 2A,B). טרופוביסטים נודדים מתעוררים בשלבים מאוחרים יותר של תרבות העובר המורחבת ותוכל לאסוף אותם ב-D12 לפני עיכול אנזימטי של העובר כולו (איור 2א’, ב). על ידי הפרדת שלוש קווי משנה אלה trophoblast לפני ניתוח תא יחיד, אנחנו יכולים לזהות סמנים תעתיק ספציפיים ולהגדיר את התפקיד הביולוגי של כל סוג תא. Cytotrophoblast הם משגשגים מאוד לפעול כתאי אב אדם באספקת תוחסין מובדיל STB ו MTB10,11,12,13. Syncytiotrophoblast מעורבים בייצור הורמוני שליה כדי לשמור על ההריון, עשוי להיות גם אחראי על העוברים חופרים לתוך ריריתהרית הים 10,,11,,12,,13. trophoblast נודד יש תכונות חזקות עוד יותר של פנוטיפ פולשני, נודד והם כנראה אחראים להתיישבות עמוקה ונרחבת יותר של ריריתהרחם הרחם 10,,11,12,,13. לאחר הגדרת החתימה transcriptomic של כל סוג תא, ניתוחי קיבוץ באשכולות חשפו גם שתי קבוצות משנה נוספות של תאים שלא ניתן להבחין מורפולוגית מ CTB והיה transcriptomes עם תכונות של STB ו MTB,בהתאמה 12. תאי שלב ביניים אלה הם כנראה בתהליך של הבדיל CTB או MTB או STB sublineages והיה להתעלם אם עוברים היו מתעכלים באופן עיוור ותאים הופרדו על ידי transcriptome לבד.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במערכת תרבות דו-ממדית (דו-ממדית) ולא יכול להיות אופטימלי לתמיכה בפיתוח מבני תלת מימדי (תלת-ממדי), כפי שהוצע בפרסום שפורסם לאחרונה המתאר מערכת תרבות תלת-ממדית שפותחהלאחרונה 13. אף על פי כן, במערכת דו-מית-מית-מית-ת- נראית כך שההבחנה של טרופהובלסט מוקדמת עולה בקנה אחד עם תצפיות שנעשו בדגימות vivo14,15,16,17. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מותאם בקלות לשימוש במערכת תרבות 3D שתוארה לאחרונה13 עם שינויים מינימליים. כל הצעדים מתבצעים עם פיפטה מיקרו-מאניאלית ידנית עם טיפים חד-פעמיים זמינים מסחרית או פיפטת פה מפיפטת זכוכית נשלפת דק המחוברת לצינורות גומי, מסנן ופיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
התפתחות הפרוטוקול לתרבות עוברים אנושיים באמצעות השתלה אפשרה למדענים לחקור תקופה לא ממופה בעבר בפיתוח8,9. כאן, אנו משתמשים במערכת תרבות מורחבת כדי לתרבות עוברים אנושיים וללמוד בידול trophoblast מוקדם לפני היווצרות שליה villous. השיטות המתוארות כאן מאפשרות לנו לאסוף …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להכיר בחולים הרבים במרכז קולורדו לרפואת פוריות (CCRM) שתרמו באדיבות את העוברים שלהם למחקר. ברצוננו גם להודות קארן Maruniak ואת המעבדה הקלינית ב CCRM על עזרתם בעיבוד דגימות hCG, כמו גם סו מקורמיק וצוות אמבריולוגיה הפריה חוץ גופית קלינית שלה ב CCRM על עזרתם עם איסוף עובר, אחסון, מעקב, ותרומה. המימון סופק באופן פנימי על ידי CCRM.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
