Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani
Summary
Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.
Abstract
L’impianto umano, l’apposizione e l’adesione all’epitelia della superficie uterina e la successiva invasione della blastocisti nel decidua materno, è un evento biologico critico ma enigmatico che è stato storicamente difficile da studiare a causa di limitazioni tecniche ed etiche. L’impianto è iniziato dallo sviluppo del trophectoderm al trofoblasto precoce e dalla successiva differenziazione in sottolinea trofoblasto distinta. La differenziazione aberrante precoce del trofoblasto può portare a insufficienza di impianto, patologie placentiali, anomalie fetali e aborto spontaneo. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per consentire agli embrioni umani di crescere fino al giorno 13 dopo la fecondazione in vitro in assenza di tessuti materni, un periodo di tempo che comprende il periodo di impianto nell’uomo. Questo ha dato ai ricercatori l’opportunità di studiare l’impianto umano e ricapitolare le dinamiche della differenziazione trofoblasta durante questo periodo critico senza confondere le influenze materne ed evitare ostacoli intrinseci allo studio degli eventi di differenziazione precoce degli embrioni in vivo. Per caratterizzare diverse sottolinea trofoblastiche durante l’impianto, abbiamo adottato metodi di coltura estesi bidimensionali (2D) esistenti e sviluppato una procedura per digerire e isolare in modo esipetino e isolare diversi tipi di cellule trofoblaste per i test a valle. Gli embrioni se nessiti in condizioni 2D hanno una morfologia relativamente appiattita e possono essere non ottimali nella modellazione di architetture embrionali tridimensionali (3D) in vivo. Tuttavia, la differenziazione dei trofoblasti sembra essere meno influenzata, come dimostrato dai cambiamenti previsti della morfologia e dell’espressione genica nel corso della coltura estesa. Diverse sottolinea trofoblas, tra cui citotrophoblast, syncytiotrophoblast e trofoblast migratorio possono essere separati per dimensione, posizione e apparizione temporale, e utilizzati per ulteriore caratterizzazione o sperimentazione. L’analisi di queste cellule trofoblastiche precoci può essere determinante per comprendere l’impianto umano, nel trattamento di comuni patologie place-sina, e mitigare l’incidenza della perdita di gravidanza.
Introduction
L’impianto umano e l’emergere della placenta precoce sono storicamente difficili da indagare e rimangono in gran parte sconosciuti perché i tessuti umani sono inaccessibili in questa fase quando la gravidanza è clinicamente inosservabile. I modelli animali sono inadeguati, in quanto la placentation umana ha le sue caratteristiche uniche rispetto ad altri mammiferi eutermici. Ad esempio, la placenta umana invade profondamente il decidua con alcune cellule trofoblaste che raggiungono almeno il terzo interno del miometrio uterino mentre altre cellule rimodellano le arterie a spirale uterina. Anche i nostri antenati evoluzionari più vicini, i primati non umani, mostrano differenze nella morfologia placenuale e nelle interazioni trofoblastiche con i tessuti decidualimaterni 1,2,3. Ottenere embrioni umani pre-impiantamenti in vitro non è stato possibile fino agli anni ’80, quando la fecondazione clinica in vitro umana (IVF) è iniziata come pratica di routine per il trattamento dell’infertilità4. Ora, le blastociti umane possono essere coltivate in vitro per consentire la selezione di embrioni più vitali per il trasferimento, oltre a consentire test genetici sicuri. Il miglioramento delle tecniche di coltura degli embrioni, nonché il crescente uso della fecondazione in vitro hanno prodotto molti blastocici in eccesso che rimangono dopo che i cicli di trattamento del paziente sono stati completati. Con il consenso del paziente, l’approvazione dell’IRB e, con alcune restrizioni, queste blastocici possono essere utilizzate per studi di ricerca. Sono diventati una risorsa inestimabile che sono stati utilizzati per la derivazione delle cellule staminali embrionaliumane 5, comprendendo la transizione della massa cellulare interna alle cellule staminali embrionali6,7, e più recentemente, sono state culturezzate con successo fino al giorno (D) 13 per rimodellare l’impianto umano8,9. Utilizzando approcci omici a singola cellula recentemente sviluppati, l’accesso a questi tessuti embrionali umani in fase di impianto ha offerto opportunità uniche per descrivere i meccanismi molecolari che regolano questo processo di differenziazione cellulare altamente dinamico, che in precedenza eranoimpossibili da esplorare 10,11,12,13.
Qui, descriviamo i metodi utilizzati nella nostra recente pubblicazione caratterizzando la dinamica della differenziazione trofoblasa durante l’impianto umano12. Questo protocollo include il riscaldamento delle blastocità vetrificate, la coltura embrionale estesa fino al D12 dopo la fecondazione in vitro, la digestione ezimatica dell’embrione in singole cellule e la raccolta di cellule per i test a valle (Figura 1). Questo sistema di coltura estesa supporta lo sviluppo dell’embrione umano in fase di peri-impianto senza input materno e ricapitola la differenziazione trofoblasto che appare coerente con le osservazioni fatte da campioni statologici molti anni fa14,15,16,17. Durante l’impianto, la popolazione trofoblasa è costituita da almeno due tipi di cellule: il citotrophoblast mononucleato simile a un progenitore (CTB) e il sintootropoblast (STB) differenziato terminalemente e multinucleato. Al momento della digestione della trypsina, il CTB sono piccole cellule rotonde che sono morfologicamente indistinguibili da altre linee cellulari (Figura 2A, pannello sinistro). La separazione del CTB da altre linee cellulari, come l’epiblast e l’endoderma primitivo, può essere ottenuta con i loro profili trascrittori distinti rivelati dal sequenziamento dell’RNA a singola cellula. Le cellule sincitiotrofoblast possono essere facilmente identificate come strutture di forma irregolare che sono significativamente più grandi rispetto agli altri tipi di cellule e si trovano principalmente alla periferia dell’embrione (Figura 2A, pannello centrale; Figura 2B, pannello sinistro). Le cellule trofoblaste migratorie (MTB) sono un’altra sottolinea trofoblasa trovata durante la coltura estesa degli embrioni e possono essere riconosciute come apparentemente allontanate dal corpo principale dell’embrione (Figura 2A, pannello a destra, Figura 2B, pannello destro). Il trofoblasto migratorio, pur esprimendo molti degli stessi marcatori del trofoblasto extra villous (EVT), non dovrebbe essere indicato come EVT, poiché le strutture villous nella placenta non sono emerse in questa fase molto precoce dello sviluppo.
Sperimentalmente, siamo stati in grado di raccogliere piccoli CTB e STB di grandi dimensioni che sono facilmente distinguibili dopo che gli embrioni sono stati digeriti in singole cellule a D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). I trofoblasti migratori si presentano nelle fasi successive della coltura embrionale estesa e possono essere raccolti al D12 prima della digestione ezimatica dell’intero embrione (Figura 2A,B). Separando fenotipicamente queste tre sottolinea trofoblaste prima dell’analisi a singola cellula, possiamo identificare specifici marcatori trascrizioniomici e definire il ruolo biologico di ogni tipo di cellula. I citotropoblasti sono altamente prolifertivi e agiscono come cellule progenitrici nella fornitura delle linee differenziate STB e MTB10,11,12,13. I syncytiotrophoblast sono coinvolti nella produzione di ormoni placental per mantenere la gravidanza e possono anche essere responsabili degli embrioni che scavano nell’endometrio10,11,12,13. Il trofoblasto migratorio ha caratteristiche ancora più forti di un fenotipo invasivo e migratorio e sono probabilmente responsabili di una colonizzazione più profonda e più estesa dell’endometriouterino 10,11,12,13. Dopo aver definito la firma trascrittimica di ogni tipo di cellula, le analisi di clustering hanno anche rivelato due sottoinsiemi aggiuntivi di cellule che erano morfologicamente indistinguibili da CTB e avevano trascrittimi con caratteristiche di STB e MTB,rispettivamente 12. Queste cellule dello stadio intermedio sono probabilmente nel processo di differenziazione da CTB alle sottolinea MTB o STB e sarebbero state trascurate se gli embrioni fossero stati digeriti ciecamente e le cellule fossero state separate solo dal trascrimama.
Il protocollo qui descritto utilizza un sistema di coltura bidimensionale (2D) e potrebbe non essere ottimale per supportare lo sviluppo strutturale tridimensionale (3D), come suggerito da una recente pubblicazione che descrive un sistema di coltura 3Ddi recente sviluppo 13. Tuttavia, in questo sistema 2D la differenziazione del trofoblasto precoce sembra essere coerente con le osservazioni fatte da esemplari in vivo14,15,16,17. Questo protocollo può anche essere facilmente adattato per l’uso nel sistema di coltura 3D13 recentemente descritto con modifiche minime. Tutti i passaggi vengono eseguiti con una pipetta di micromanipolazione portatile con punte usa e getta disponibili in modo commerciale o una pipetta per bocca da una pipetta di vetro finemente tirata attaccata a tubi di gomma, un filtro e un boccaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo del protocollo per la coltura degli embrioni umani attraverso l’impianto ha permesso agli scienziati di esplorare un tempo precedentemente inesplorate nellosviluppo 8,9. Qui, usiamo un sistema di coltura esteso per colturare gli embrioni umani e studiare la differenziazione trofoblasto precoce prima della formazione della placenta villous. I metodi descritti qui ci permettono di raccogliere diverse sottolinea TB da utilizzare nell’analisi a cella sing…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere i molti pazienti del Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) che hanno gentilmente donato i loro embrioni per la ricerca. Vorremmo anche ringraziare Karen Maruniak e il laboratorio clinico di CCRM per il loro aiuto nell’elaborazione di campioni di hCG, così come Sue McCormick e il suo team clinico di embriologia in fecondazione in vitro presso CCRM per il loro aiuto nella raccolta, stoccaggio, monitoraggio e donazione degli embrioni. Il finanziamento è stato fornito internamente da CCRM.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
