ヒト胚形成期における栄養芽細胞の単一細胞回収
Summary
ここでは、ガラス化されたヒト胚盤胞を温め、インビトロでの移植期間を通じてそれらを培養し、それらを単一細胞に消化し、さらなる調査のために早期の栄養芽細胞を採取する方法を説明する。
Abstract
ヒト移植、子宮表面上皮への有理および接着、およびその後の胚盤胞の母体デシドゥアへの侵入は、技術的および倫理的な制限のために歴史的に研究が困難であった重大でありながら謎めいた生物学的事象である。移植は、栄養細胞の初期に対する栄養細胞の発達と、その後の分化によって始まり、別個の栄養芽細胞サブラインに移行する。異常な早期の栄養芽細胞分化は、移植不全、胎盤病変、胎児異常、流産を引き起こし得る。最近では、ヒトの移植期間を包含する期間である母体組織がない場合、ヒト胚が13日目まで体外で受精して成長できるようにする方法が開発されている。これにより、研究者は、母親の影響を混乱させ、生体内の初期胚分化事象を研究するための固有の障害を避けることなく、この重要な期間中にヒト移植を調査し、栄養芽細胞分化のダイナミクスを再現する機会を与えました。移植時に異なる栄養芽細胞のサブラインを特徴付けるために、既存の2次元(2D)拡張培養法を採用し、下流アッセイ用の異なるタイプの栄養芽細胞を酵素的に消化および単離する手順を開発しました。2D条件で培養された胚は比較的平坦な形態を有し、生体内3次元(3D)胚アーキテクチャのモデリングにおいて最適でない可能性がある。しかし、栄養芽細胞分化は、拡張培養の過程で予想される形態および遺伝子発現の変化によって示されるように、影響を受けにくいようです。細胞トトロフォブラスト、シンクチオトロホブラスト、回遊性栄養芽細胞を含む異なる栄養芽細胞サブリニアは、サイズ、位置、および時間的出現によって分離することができ、さらなる特徴付けまたは実験に使用される。これらの初期の栄養芽細胞の調査は、ヒト移植の理解、一般的な胎盤病理の治療、および妊娠喪失の発生率の軽減に役立つ可能性がある。
Introduction
ヒト移植と初期胎盤の出現は、妊娠が臨床的に検出できないこの段階ではヒト組織にアクセスできないため、歴史的に調査することは困難であり、ほとんど知られていない。ヒトの胎盤は他のユーテリア哺乳類と比較して独自の特徴を持つため、動物モデルは不十分です。例えば、ヒト胎盤は、いくつかの栄養芽細胞が子宮筋膜の少なくとも3分の1に達し、他の細胞が子宮渦巻動脈を改造しながら、デシドゥアに深く侵入する。私たちの最も近い進化の祖先、非ヒト霊長類でさえ、胎盤形態と栄養芽細胞の相互作用の違いを母体の異形組織11、2、32,と示す。インビトロで移植前ヒト胚を得る術体は、臨床ヒト体外受精(IVF)が不妊治療のための日常的な診療として始まった1980年代まで不可能であった4。現在、ヒト胚盤胞をインビトロで増殖させて、より実行可能な胚を移動可能にし、安全な遺伝子検査を可能にすることができる。胚培養技術の改善、ならびにIVFの使用の増加は、患者の治療サイクルが完了した後も残っている多くの余剰胚盤胞を生み出した。患者の同意、IRBの承認、および一定の制限により、これらの胚盤胞は研究研究のために利用することができる。それらはヒト胚性幹細胞5の誘導に用いられた貴重な資源となっており、胚性幹細胞6、77への内細胞塊の転移を理解し、さらに最近6では、ヒト移植88,99を改造するために日(D)13まで培養に成功している。最近開発された単一細胞オミクスアプローチを利用することにより、ヒト胚組織の移植段階へのアクセスは、この非常に動的な細胞分化プロセスを調節する分子メカニズムを記述するユニークな機会を提供10,11,12,してきた。
ここでは、ヒト移植時の栄養芽細胞分化のダイナミクスを特徴づける最近の刊行物で用いる方法を説明する12.このプロトコルには、ガラス化胚盤胞の温暖化、D12ポストIVFまでの拡張胚培養、胚を単一細胞に酵素的に消化すること、および下流アッセイ用の細胞採取が含まれる(図1)。この拡張培養システムは、母親の入力なしにヒト胚発生期の培養期をサポート,し、14年前、15年、16,16年、17年前の組織学的標本からの観察と一致して出現する栄養芽細胞分化を再現する。移植中、栄養芽細胞集団は、少なくとも2つの細胞タイプで構成される:単核化前駆細胞様細胞栄養芽細胞(CTB)および末端分化された多核同期栄養芽細胞(STB)。トリプシン消化の際、CTBは、形態学的に他の細胞系語と区別がつかない小さな丸い細胞である(図2A、左パネル)。エピブラストや原始の内胚葉などの他の細胞系統からのCTBの分離は、単一細胞RNAシーケンシングによって明らかにされるそれらの明確なトランスクリプトミックプロファイルによって達成することができる。同期性TROPhoblast細胞は、他の細胞型よりも著しく大きく、主に胚の周囲に位置する不規則な形状の構造として容易に同定することができる(図2A、中間パネル;図2B、左パネル)。回遊性栄養芽細胞(MTB)は、胚拡張培養中に見られるもう一つの栄養芽細胞サブリリネージであり、胚の本体から離れて移動しているように見える(図2A、右パネル、図2B、右パネル)。遊覧栄養芽球は、余分な絨毛性トロホブラスト(EVT)と同じマーカーの多くを表現するが、胎盤の絨毛構造が開発のこの非常に初期の段階で出現していないので、EVTと呼ばれるべきではない。
実験的に、胚がD8、D10、およびD12で単一細胞に消化された後に容易に識別可能な小さなCTBおよび大きなSTBを収集することができた(図2A、B)。渡り性栄養芽細胞は、拡張胚培養の後期段階で生じ、胚全体の酵素消化の前にD12で収集することができる(図2A,B)。単一細胞解析の前にこれら3つの栄養芽細胞副系統を分けることによって、我々は特定の転写マーカーを同定し、各細胞タイプの生物学的役割を定義することができる。細胞トトロホブラストは増殖性が高く、STBおよびMTB分化系統10、11、12、13,12,を供給する前駆細胞として作用する。10,13シンクジオトロフォブラストは、妊娠を維持するために胎盤ホルモンの産生に関与し、子宮内膜10、11、12、13,11,12に巣を掘る胚の原因でもある。,13回遊性栄養芽球は、侵襲的な、回遊性表現型のさらに強い特徴を有し、子宮内膜10、11、12、13,11,12のより深く、より広範なコロニー形成を担う可能性が高い。,13各細胞型の転写シグネチャを定義した後、クラスタリング分析はまた、CTBと形態学的に区別がつかない細胞の2つの追加サブセットを明らかにし、それぞれSTBおよびMTBの特徴を有する転写体を有していた12を有する。これらの中間段階の細胞は、CTBからMTBまたはSTBのサブリニアのいずれかに分化する過程にある可能性が高く、胚が盲目的に消化され、細胞がトランスクリプトームだけで分離された場合、見落とされていたであろう。
ここで説明するプロトコルは、2次元(2D)培養系を利用しており、3次元(3D)構造開発を支持するのに最適でない可能性があり、新開発された3D培養システム13を記述する最近の刊行物で示唆されている。それにもかかわらず、この2D系では、初期の栄養芽細胞の分化は、生体内試料14、15、16、1715,16,17からの観測と一致しているようです。14このプロトコルはまた、最近説明した3D培養システム13における使用に対して、最小限の変更で容易に適応され得る。すべてのステップは、市販の使い捨てチップを備えたハンドヘルドマイクロマニピュレーションピペット、またはゴムチューブ、フィルター、マウスピースに取り付けられた細かく引っ張られたガラスピペットからの口ピペットで行われます。
Protocol
Representative Results
Discussion
移植を通じてヒト胚を培養するプロトコルの開発は、科学者が開発88、9で未知の時間を探求することを可能にしました。ここでは、ヒト胚を培養し、絨毛胎盤の形成前に早期の栄養芽細胞分化を研究するために拡張培養システムを使用する。ここで説明する方法により、下流の単一細胞解析で使用するために異なる結核サブリネーを収集すること?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
コロラド生殖医学センター(CCRM)の多くの患者が、研究のために胚を優雅に寄付したことを認めたいと思います。また、カレン・マルニアックとCCRMの臨床検査室に対し、hCGサンプルの処理に協力してくれたことに感謝し、CCRMのスー・マコーミックと彼女の臨床IVF発生学チームは、胚の収集、保管、追跡、寄付に協力してくれたことに感謝します。資金はCCRMによって内部的に提供されました。
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
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