페리 이식 단계 인간 배아에서 트로포 블라스트 세포의 단일 세포 수집
Summary
여기에서, 우리는 시험관내 이식 기간을 통해 그(것)들을 배양하고, 단 하나 세포로 소화하고 추가 조사를 위한 초기 trophoblast 세포를 수집하는 유리한 인간 blastocysts를 온난화하는 방법을 기술합니다.
Abstract
인간의 이식, 자궁 표면 상피에 대한 정착 및 접착및 모계 데시두아에 배반증이 잇따라 침입한 것은 기술적, 윤리적 한계로 인해 역사적으로 연구하기가 어려웠던 중요하면서도 수수께끼같은 생물학적 사건이다. 이식은 초기 트로포 블라스트에 트로페토데름의 개발과 뚜렷한 열대 성세포 하위로 후속 분화에 의해 시작된다. 비정상적인 초기 트로포블라스트 분화는 이식 실패, 태반 병리, 태아 이상 및 유산으로 이어질 수 있습니다. 최근에는 인간 배아가 인체의 이식 기간을 포괄하는 시동 조직부재에서 체외에서 13일째까지 자라도록 하는 방법이 개발되었다. 이것은 연구원에게 인간 이식을 조사하고 모성의 영향을 혼동하고 생체 내초기 배아 분화 사건을 연구하기 위하여 내재된 장애물을 피하지 않고 이 중요한 기간 도중 trophoblast 분화의 역학을 재정의할 기회를 주었습니다. 이식 중 상이한 트로프토블라스트 서브라인지를 특성화하기 위해 기존의 2차원(2D) 확장 배양 방법을 채택하고 하류 분해를 위해 다양한 유형의 트로피컬블라스트 세포를 효소적으로 소화하고 분리하는 절차를 개발했습니다. 2D 조건에서 배양된 배아는 비교적 평평한 형태를 가지며 생체 내 3차원(3D) 배아 아키텍처에서 모델링에 최적이 아닐 수 있다. 그러나, trophoblast 분화는 확장된 문화의 과정을 통해 예상된 형태학 및 유전자 발현 변경에 의해 입증된 바와 같이 보다 적게 영향을 받는 것처럼 보입니다. 사이토트로토블라스트, 싱크티오트로포블라스트 및 철새 트로포블라스트를 포함한 다른 열대성 아열대는 크기, 위치 및 측두적인 출현으로 구분될 수 있으며, 추가 특성화 또는 실험에 사용될 수 있다. 이 초기 trophoblast 세포의 조사는 일반적인 태반 병리를 취급하고, 임신 손실의 부각을 완화하는 인간 이식을 이해하는 중요한 역할을 할 수 있습니다.
Introduction
인간의 이식과 초기 태반의 출현은 역사적으로 어렵고 임신이 임상적으로 감지 할 수없는 경우 이 단계에서 인간의 조직에 접근 할 수 없기 때문에 크게 알려지지 않았습니다. 인간 태반은 다른 유테리안 포유류에 비해 고유 한 특징을 가지고 있기 때문에 동물 모델은 부적절합니다. 예를 들어, 인간의 태반은 다른 세포가 자궁 나선형 동맥을 리모델링하는 동안 자궁 근막의 적어도 내부 3 분의 1에 도달하는 일부 영양 세포와 데시두아 깊숙이 침입한다. 심지어 우리의 가장 가까운 진화 조상, 비 인간 영장류, 모계 decidual조직1,,2,,3과태반 형태와 열대 성술 상호 작용의 차이를 보여줍니다 . 체외에서 이식 전 인간 배아를 얻는 것은 1980년대까지 는 임상 인간이 체외 수정(IVF)이불임치료를 위한 일상적인 관행으로 시작될 때까지 가능하지 않았다. 지금, 인간 blastocysts는 전송을 위한 더 실행 가능한 태아의 선택을 허용하기 위하여 시험관에서 성장될 수 있고, 뿐만 아니라 안전한 유전 시험을 가능하게 합니다. 배아 배양 기술의 개선뿐만 아니라 IVF의 사용이 증가함에 따라 환자의 치료 주기가 완료된 후에도 남아있는 많은 잉여 배반증을 산출했습니다. 환자의 동의, IRB 승인 및 특정 제한으로 이러한 배반구는 연구 연구에 사용될 수 있습니다. 그(것)들은 인간 배아 줄기 세포의 유도를 위해 이용된 귀중한 자원이 되었다5,배아 줄기 세포로 내부 세포 질량의 전이를이해6,,7,그리고 더 최근에, 성공적으로 인간이식8,,9를리모델링하기 위하여 일 (D) 13까지 배양되었다. 최근에 개발된 단일 세포 오믹스 접근법을 활용함으로써, 이러한 이식 단계 인간 배아 조직에 대한 접근은 이전에는 10,11,12,,13을탐구하는 것이 불가능했던 이 고동적인 세포 분화 과정을 조절하는 분자 메커니즘을 설명할 수 있는 독특한 기회를 제공했다.,,
여기서, 우리는 인간이식(12)동안 트로포블라스트 분화의 역학을 특징으로 하는 최근 간행물에 사용된 방법을 설명한다. 본 프로토콜은 유리화된 blastocysts의 온난화, D12 포스트 IVF까지 확장된 배아 배양, 단일 세포로의 배아의 효소 소화, 하류 분석에 대한 세포 수집을포함한다(도 1). 이러한 확장배양 시스템은 모계 입력 없이 peri-이식 단계 인간 배아 발달을 지원하고 수년 전 조직학적 표본으로부터 이루어진 관찰과 일치하는 트로포블라스트 분화를 재구성하여14년 전,,15,,16,,17을지원합니다. 이식 하는 동안, trophoblast 인구는 적어도 두 개의 세포 유형으로 구성: 단핵 된 선조 같은 cytotrophoblast (CTB) 그리고 말단 분화, 다핵 싱크itiotrophoblast (STB). 트립신 소화시 CTB는 다른 세포 계보와 형태학적으로 구별할 수 없는 작고 둥근 세포입니다(도2A,왼쪽 패널). 에피블라스트 및 원시 적 엔데담과 같은 다른 세포 계보로부터 CTB의 분리는 단세포 RNA 염기서열에 의해 드러난 뚜렷한 전사 프로파일에 의해 달성될 수 있다. Syncytiotrophoblast 세포는 쉽게 다른 세포 유형보다 상당히 큰 불규칙한 모양의 구조로 쉽게 식별 될 수 있으며 주로 배아의 주변에 위치(도 2A,중간 패널; 그림 2B,왼쪽 패널). 철새 트로포블라스트 세포(MTB)는 배아 확장 배양 중에 발견되는 또 다른 트로포블라스트 서브라인이며 배아의 본체에서 멀어지는 것처럼 인식될 수있다(도 2A,오른쪽 패널, 도 2B,오른쪽 패널). 철새 트로포블라스트는 여분의 빌루스 트로포블라스트 (EVT)와 같은 마커의 많은 표현하지만, 태반의 villous 구조는 개발의 이 초기 단계에서 등장하지 않았기 때문에 EVT로 언급되어서는 안됩니다.
실험적으로, 우리는 배아가 D8, D10 및 D12(그림2A, B)에서단일 세포로 소화된 후에 쉽게 구별할 수 있는 작은 CTB 및 큰 STB를 수집할 수 있었습니다. 철새 열대성 세포는 확장된 배아 배양의 후기 단계에서 발생하며 전체 배아의 효소 소화 전에 D12에서 수집될 수있다(그림 2A, B). 단일 세포 분석 전에 이러한 3개의 트로포블라스트 하위계를 전형적으로 분리함으로써, 우리는 특정 전사 마커를 식별하고 각 세포 유형의 생물학적 역할을 정의할 수 있다. 세포로포스트는 매우 증식되어 있으며 STB 및 MTB 분화 혈통10,11,,,12,,13을공급하는 선조 세포역할을 한다. Syncytiotrophoblast는 임신을 유지하기 위하여 태반 호르몬을 생산에 관여하고 또한 자궁 내측으로 잠복하는 태아에 책임 있을 지도 모릅니다10,,11,,12,,13. 철새 트로포블라스트는 침략적이고 철새 현상형의 더 강한 특징을 가지고 있으며 자궁 내막관10,11,12,13의더 깊고 광범위한 식민지화를담당할가능성이 높습니다.,, 각 세포 유형의 전사 적 서명을 정의 한 후, 클러스터링 분석은 또한 CTB와 형태학적으로 구별할 수 없는 세포의 2개의 추가 하위 집합을 밝혔으며 각각12개의STB 및 MTB의 특징을 가진 전사를 가졌다. 이 중간 단계 세포는 CTB에서 MTB 또는 STB 하위라인으로 분화하는 과정에서 가능성이 높으며 배아가 맹목적으로 소화되고 세포가 전사에 의해단독으로 분리되었다면 간과되었을 것입니다.
여기서 설명된 프로토콜은 2차원(2D) 배양 시스템을 활용하고 새로 개발된 3D 배양시스템(13)을설명하는 최근 간행물에 의해 제안된 바와 같이 3차원(3D) 구조 개발을 지원하는 데 최적이 아닐 수 있다. ,그럼에도 불구하고, 이 2D 시스템에서 초기 트로포블라스트의 분화는 생체 내표본(14,15,16,17)에서이루어진관찰과일치하는 것으로 보인다., 또한 이러한 프로토콜은 최소한의 변경으로 최근에 설명된 3D 배양시스템(13)에서의 사용에 맞게 용이하게 적용될 수 있다. 모든 단계는 고무 튜브, 필터 및 마우스피스에 부착 된 미세하게 당겨진 유리 파이펫에서 시판 되는 일회용 팁 또는 입 파이펫이있는 휴대용 마이크로 조작 파이펫으로 수행됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이식을 통해 인간 배아를 배양하는 프로토콜의 개발은 과학자들이 개발8,,9에서이전에 미지의 시간을 탐구할 수 있게 해 주었다. 여기서, 우리는 인간 배아를 배양하고 villous 태반의 형성 전에 초기 trophoblast 분화를 연구하기 위하여 확장된 배양 시스템을 이용합니다. 여기에 설명된 방법은 다운스트림 단세포 분석에 사용하기 위해 다른 TB 하위계를 수?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 콜로라도 생식 의학 센터 (CCRM)의 많은 환자들이 연구를 위해 자신의 배아를 정중하게 기증한 것을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 카렌 마루니아크와 hCG 샘플 처리에 그들의 도움에 대한 CCRM의 임상 실험실뿐만 아니라, 고소 맥코믹과 그녀의 임상 IVF 배아 팀이 배아 수집, 저장, 추적 및 기부에 대한 도움을 주셔서 감사합니다. 자금 조달은 CCRM에 의해 내부적으로 제공되었습니다.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
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