Enkeltcellesamling av trofoblastceller i Peri-implantasjonsstadium humane embryoer

Summary

Her beskriver vi en metode for oppvarming av vitrifiserte humane blastocysts, culturing dem gjennom implantasjonsperioden in vitro, fordøye dem i enkeltceller og samle tidlige trophoblast celler for videre undersøkelse.

Abstract

Menneskelig implantasjon, apposisjon og vedheft til livmoroverflaten epitelia og påfølgende invasjon av blastocyst inn i mors decidua, er en kritisk, men gåtefull biologisk hendelse som har vært historisk vanskelig å studere på grunn av tekniske og etiske begrensninger. Implantasjon initieres ved utvikling av trophectoderm til tidlig trofoblast og påfølgende differensiering i distinkte trophoblast-underlinjer. Avvikende tidlig trophoblast differensiering kan føre til implantasjonssvikt, placentapatologier, føtale abnormiteter og abort. Nylig har metoder blitt utviklet for å tillate menneskelige embryoer å vokse til dag 13 post-befruktning in vitro i fravær av mors vev, en tidsperiode som omfatter implantasjonsperioden hos mennesker. Dette har gitt forskere muligheten til å undersøke menneskelig implantasjon og rekafulere dynamikken i trophoblast differensiering i denne kritiske perioden uten forvirrende mors påvirkninger og unngå iboende hindringer for å studere tidlige embryodilateringshendelser in vivo. For å karakterisere ulike trophoblast-underlinjer under implantasjon, har vi vedtatt eksisterende todimensjonale (2D) utvidede kulturmetoder og utviklet en prosedyre for å enzymatisk fordøye og isolere ulike typer trofoblastceller for nedstrøms analyser. Embryoer dyrket i 2D-forhold har en relativt flat morfologi og kan være suboptimal i modellering in vivo tredimensjonale (3D) embryonale arkitekturer. Trophoblast differensiering synes imidlertid å være mindre påvirket som demonstrert av forventet morfologi og genuttrykksendringer i løpet av utvidet kultur. Ulike trophoblast underordnede, inkludert cytotrophoblast, syncytiotrophoblast og trekktrophoblast kan skilles etter størrelse, plassering og temporal fremvekst, og brukes til videre karakterisering eller eksperimentering. Undersøkelse av disse tidlige trofoblastcellene kan være medvirkende til å forstå menneskelig implantasjon, behandle vanlige placentapatologier og redusere forekomsten av graviditetstap.

Introduction

Menneskelig implantasjon og fremveksten av den tidlige morkaken er historisk vanskelig å undersøke og forblir i stor grad ukjent fordi menneskelig vev er utilgjengelig på dette stadiet når graviditet er klinisk umulig å oppdage. Dyremodeller er utilstrekkelige, da menneskelig placentation har sine egne unike egenskaper sammenlignet med andre eutherian pattedyr. For eksempel invaderer menneskelig placenta dypt inn i decidua med noen trophoblastceller som når minst den indre tredjedelen av livmormyometriummens andre celler omformer livmorspiralarteriene. Selv våre nærmeste evolusjonære forfedre, de ikke-menneskelige primater, viser forskjeller i placenta morfologi og trophoblast interaksjoner med mors decidual vev^1,,2,,3. Å oppnå preimplantasjon humane embryoer in vitro var ikke mulig før på 1980-tallet da klinisk human in vitro befruktning (IVF) startet som en rutinemessig praksis for behandling av infertilitet⁴. Nå kan menneskelige blastocysts dyrkes in vitro for å tillate valg av mer levedyktige embryoer for overføring, samt muliggjøre sikker genetisk testing. Forbedring i embryokulturteknikker, samt den økende bruken av IVF har gitt mange overskuddsblastocyster som gjenstår etter at pasientens behandlingssykluser er fullført. Med pasientens samtykke, IRB-godkjenning, og med visse restriksjoner, kan disse blastocystene brukes til forskningsstudier. De har blitt en uvurderlig ressurs som ble brukt til avledning av humane embryonale^{stamceller 5,}forstå overgangen av indre cellemasse til embryonale^{stamceller 6,7,}og mer nylig, har blitt vellykket dyrket til dag (D) 13 å ombygge menneskelig implantasjon^8,9. Ved å bruke nylig utviklede encellede omics tilnærminger, har tilgangen til disse implantasjonsstadiet menneskelig embryovev tilbudt unike muligheter til å beskrive molekylære mekanismer som regulerer denne svært dynamiske cellediensisjonsprosessen, som tidligere var umulig å^{utforske 10,11,12,13}.

Her beskriver vi metodene som brukes i vår nylige publikasjon som karakteriserer dynamikken i trofoblastdilatering under menneskelig implantasjon¹². Denne protokollen inkluderer oppvarming av vitrifiserte blastocysts, utvidet embryokultur opp til D12 post IVF, enzymatisk fordøyelse av embryoet i enkeltceller, og cellesamling for nedstrøms analyser (figur 1). Dette utvidede kultursystemet støtter peri-implantasjonsstadium menneskelig embryoutvikling uten mors innspill og rekavalerer trophoblast differensiering som ser ut til å være i samsvar med observasjonene fra histologiske prøver for mange år^{siden 14,15,16,17}. Under implantasjon består trofoblastpopulasjonen av minst to celletyper: mononuklet stamcellelignende cytotrophoblast (CTB) og terminalt differensiert, multinuklert syncytiotrophoblast (STB). Ved trypsin fordøyelsen er CTB små, runde celler som er morfologisk umulig å skille fra andre cellelinjer (Figur 2A, venstre panel). Separasjon av CTB fra andre cellelinjer, som epiblast og primitiv endoderm, kan oppnås ved deres distinkte transkripsjonsprofiler avslørt ved encellede RNA-sekvensering. Syncytiotrophoblast celler kan lett identifiseres som uregelmessige formede strukturer som er betydelig større enn de andre celletypene og hovedsakelig ligger i periferien av embryoet (Figur 2A, midtpanel; Figur 2B, venstre panel). Trekkfugl trophoblastceller (MTB) er en annen trophoblast sublineage funnet under embryo utvidet kultur og kan gjenkjennes som tilsynelatende beveger seg bort fra hoveddelen av embryoet (Figur 2A, høyre panel, Figur 2B, høyre panel). Trekktrophoblast, selv om de uttrykker mange av de samme markørene som ekstra villous trophoblast (EVT), bør ikke refereres til som EVT, siden de villelige strukturene i morkaken ikke har dukket opp på dette svært tidlige utviklingsstadiet.

Eksperimentelt var vi i stand til å samle små CTB og store STB som er lett skilles etter embryoer er fordøyd i enkeltceller ved D8, D10, og D12 (Figur 2A, B). Trekktrofoblaster oppstår i de senere stadiene av utvidet embryokultur og kan samles ved D12 før enzymatisk fordøyelse av hele embryoet (figur 2A, B). Ved å fenotypisk skille disse tre trophoblast-underlinjene før enkeltcelleanalyse, kan vi identifisere spesifikke transkripsjonsmiske markører og definere den biologiske rollen til hver celletype. Cytotrophoblast er svært proliferative og fungerer som stamceller i å levere STB og MTB differensierte^{avstamninger 10,,11,,12,,13}. Syncytiotrophoblast er involvert i å produsere placentahormoner for å opprettholde graviditet og kan også være ansvarlig for embryoene som graver seg inn i endometrium^10,11,12,13. Trekkfugltrophoblast har enda sterkere trekk ved en invasiv, migrerende fenotype og er sannsynligvis ansvarlig for dypere og mer omfattende kolonisering av livmoren endometrium^10,11,12,13. Etter å ha definert transkripsjonssignaturen for hver celletype, har klyngeanalyser også avdekket to ekstra undergrupper av celler som var morfologisk umulig å skille fra CTB og hadde transkripsjoner med funksjoner i STB og MTB,^{henholdsvis 12}. Disse mellomliggende fasecellene er sannsynligvis i ferd med å differensiere fra CTB til enten MTB- eller STB-underlinjene og ville ha blitt oversett hvis embryoer ble blindt fordøyd og cellene ble separert av transkripsjon alene.

Protokollen som er beskrevet her benytter et todimensjonalt (2D) kultursystem og er kanskje ikke optimal for å støtte tredimensjonal (3D) strukturell utvikling, som foreslått av en nylig publikasjon som beskriver et nyutviklet 3D-kultursystem¹³. Likevel, i dette 2D-systemet differensiering av tidlig trofoblast synes å være i samsvar med observasjoner gjort fra in vivo prøver^14,15,16,17. Denne protokollen kan også enkelt tilpasses bruken i det nylig beskrevne 3D-kultursystemet^{13 med} minimale endringer. Alle trinnene utføres med en håndholdt mikromanipuleringpipette med kommersielt tilgjengelige engangsspisser eller en munnpipette fra en fin trukket glasspipette festet til gummirør, et filter og et munnstykke.

Protocol

Alle menneskelige embryoer har blitt donert med samtykke til bruk i forskning. Protokoller for utvidet menneskelig embryokultur er godkjent av Western Institutional Review Board (studie nr. 1179872) og følger internasjonale retningslinjer. Enhver bruk av menneskelige embryoer må gjennomgås av de aktuelle etiske og styrende organer knyttet til forskningsinstitusjonen ved hjelp av denne protokollen. 1. Forberedelse Forbered media og restitusjonsplater en dag før embryooppvarming i …

Representative Results

Friske embryoer viste fortsatt spredning i løpet av utvidet kultur (Figur 2B). Unormale embryoer begynte å trekke seg tilbake fra sine ytre kanter og gå i oppløsning (figur 2C). Fra vår erfaring ble ca 75% av embryoene festet til bunnen av fibronectin belagt parabolen ved 48 timer og vedlegget økte til ca 90% av 72 timer i kultur. Suksessen til embryovedlegg kan i stor grad påvirkes av den opprinnelige kvaliteten på blastocysts. Embryoer som ikke er fest…

Discussion

Utviklingen av protokollen til kultur menneskelige embryoer gjennom implantasjon har tillatt forskere å utforske en tidligere ukjent tid i utvikling^8,9. Her bruker vi et utvidet kultursystem for å dyrke menneskelige embryoer og studere tidlig trophoblast differensiering før dannelsen av vill. Metodene som er beskrevet her tillater oss å samle forskjellige TB-underlinjer for bruk i nedstrøms encelleanalyse. Dette arbeidet gir det vitenskapelige samfunnet en s…

Materials

3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dish	VWR	62406-038	Case of 500
5 mL snap cap tube	VWR	60819-295	Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dish	VWR	25382-687	Case of 200
6-well dish	Agtech Inc.	D18	Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solution	Millipore Sigma	T1788	100 mL
Biotix 1250 µL pipette tips	VWR	76322-156	Pack of 960
Blast, blastocyst culture media	Origio	83060010	10 mL
Dilution Solution	Kitazato	VT802	1 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Thermo Fisher Scientific	1367820D	5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Millipore Sigma	D8537
Embryo culture paraffin oil OvOil	Vitrolife	10029	100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mL	VWR	47730-598	Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mL	VWR	89130-980	Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution	Millipore Sigma	F0895	1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling media	Vitrolife	10129	125 mL
Handling media	Origio	83100060	60 mL
Ibidi 8 well chambered coverslip	Ibidi	80826	15 slides per box
IVC1/IVC2	Cell Guidance Systems	M11-25/ M12-25	5-5mL aliquots
K System T47 Warming Plate	Cooper Surgical	23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane	Fisher Scientific	SLGVR33RS	Pack of 50
Mouth pieces	IVF Store	MP-001-Y	100 pieces
Oosafe center well dish	Oosafe	OOPW-CW05-1	Case of 500
Quinn's Advantage SPS	Origio	ART-3010	12x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth pieces	IVF Store	IVFS-NRL-B-5	5 ft.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270
Stripper tips	Cooper Surgical	MXL3-275	20/pk 275 µm
Thawing Solution	Kitazato	VT802	2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter	Cooper Surgical	MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	1 x 100 mL
Tween20	Millipore Sigma	P1379-25ML	25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tips	VWR	76322-134	Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tips	VWR	89174-526	Pack of 960
Washing Solution	Kitazato	VT802	1 x 4 mL