Одноклеточная коллекция трофибластных клеток в пери-имплантации этапе человеческих эмбрионов
Summary
Здесь мы описываем метод нагрева витроцистов человека, культивируя их через период имплантации в пробирке, переваривая их в одиночные клетки и собирая ранние клетки трофибласта для дальнейшего исследования.
Abstract
Имплантация человека, аппозиция и прилипание к эпителии поверхности матки и последующее вторжение бластоцист в материнское решение, является критическим, но загадочным биологическим событием, которое исторически было трудно изучить из-за технических и этических ограничений. Имплантация инициируется развитием трофикодерма до раннейтрофобласти и последующей дифференциацией в отдельные подлины трофибластов. Аномальная ранняя дифференциация трофибластов может привести к отказу имплантации, плацентарным патологиям, аномалиям плода и выкидышу. В последнее время были разработаны методы, позволяющие человеческим эмбрионам расти до 13-го дня после оплодотворения в пробирке в отсутствие материнских тканей, период времени, который охватывает период имплантации у человека. Это дало исследователям возможность исследовать имплантацию человека и резюмировать динамику дифференциации трофибластов в этот критический период, не путая материнские влияния и избегая присущих препятствий для изучения событий ранней дифференциации эмбрионов in vivo. Для характеристики различных подлинаций трофобласти во время имплантации мы приняли существующие двухмерные (2D) расширенные методы культуры и разработали процедуру для энзиматичного переваривания и изоляции различных типов трофибластных клеток для анализа ниже по течению. Эмбрионы, выучатые в 2D условиях, имеют относительно сплющенную морфологию и могут быть неоптимальными при моделировании трехмерных (3D) эмбриональных архитектур in vivo. Тем не менее, трофибласт дифференциации, как представляется, менее пострадавших, о чем свидетельствуют ожидаемые морфологии и экспрессии генов изменения в течение расширенной культуры. Различные подлины трофобласта, включая цитотрофобласт, синцитиотрофобласт и миграционную трофибласт, могут быть разделены по размеру, местоположению и временному появлению и использованы для дальнейшей характеристики или экспериментов. Исследование этих ранних клеток трофибласта может быть полезным в понимании имплантации человека, лечении общих плацентарных патологий и смягчении частоты потери беременности.
Introduction
Имплантация человека и появление ранней плаценты исторически трудно исследовать и остаются в значительной степени неизвестными, потому что человеческие ткани недоступны на данном этапе, когда беременность клинически не обнаруживается. Модели животных являются неадекватными, так как плацентация человека имеет свои уникальные особенности по сравнению с другими эвтерианскими млекопитающими. Например, человеческая плацента вторгается глубоко в decidua с некоторыми клетками trophoblast достижения по крайней мере внутренняя треть миометрия матки в то время как другие клетки реконструировать маточных спиральных артерий. Даже наши ближайшие эволюционные предки, не-человеческие приматы, показывают различия в плацентарный морфологии и трофибласт взаимодействия с материнскойрешающих тканей 1,2,3. Получение предварительной имплантации человеческих эмбрионов в пробирке было невозможно до 1980-х годов, когда клиническое оплодотворение человека в пробирке (ЭКО) началось как обычная практика длялечения бесплодия 4. Теперь, человеческие бластоцисты могут быть выращены в пробирке, чтобы обеспечить выбор более жизнеспособных эмбрионов для передачи, а также позволяют безопасное генетическое тестирование. Улучшение методов культуры эмбрионов, а также все более все более использование ЭКО дали много излишков бластоцист, который остается после цикла лечения пациента были завершены. С согласия пациента, IRB утверждения, и с определенными ограничениями, эти бластоцисты могут быть использованы для научных исследований. Они стали бесценным ресурсом, которые были использованы для получения человеческих эмбриональныхстволовых клеток 5,понимая переход внутренней клеточной массы к эмбриональным стволовым клеткам6,,7, а в последнее время, были успешно культурны до дня (D) 13для реконструкции человеческой имплантации 8,9. Используя недавно разработанные подходы одноклеточной омики, доступ к этой стадии имплантации тканей эмбриона человека предоставил уникальную возможность описать молекулярные механизмы, которые регулируют этот высокодинамительный процесс дифференциации клеток, которые ранеебыло невозможно исследовать 10,,11,12,13.
Здесь мы описываем методы, используемые в нашей недавней публикации, характеризующие динамику дифференциации трофибласта во время имплантациичеловека 12. Этот протокол включает в себя потепление vitrified бластоцисты, расширенный эмбрион культуры до D12 после ЭКО, энзиматическое переваривание эмбриона в одиночные клетки, и сбор клеток для вниз по течению анализы (Рисунок 1). Эта расширенная система культуры поддерживает пери-имплантации стадии развития эмбриона человека без материнского вклада и recapitulates трофибласт дифференциации, которая появляется в соответствии с наблюдениями, сделанными из гистологических образцовмного лет назад 14,15,16,17. Во время имплантации популяция трофибластов состоит как минимум из двух типов клеток: мононуклеастного прародителя типа цитотрофобласта (КТБ) и неизлечимо дифференцированного, многонуклеированного синцитиотрофобласта (СТБ). После пищеварения трипсина, CTB являются небольшими, круглые клетки, которые морфологически неотличимы от других клеточных линий(рисунок 2A, левая панель). Отделение CTB от других клеточных линий, таких как эпибласт и примитивный эндодерм, может быть достигнуто с помощью их различных транскриптомных профилей, выявленных одноклеточной РНК-секвенированием. Синцитиотрофобластные клетки могут быть легко идентифицированы как нерегулярные формы структур, которые значительно больше, чем другие типы клеток и в основном расположены на периферии эмбриона(рисунок 2A, средняя панель; Рисунок 2B, левая панель). Мигрирующие трофибластные клетки (МТБ) являются еще одним подлинием трофибласта, найденным во время расширенной культуры эмбриона, и могут быть признаны, казалось бы, отохаальными от основного тела эмбриона(рисунок 2A, правая панель, рисунок 2B, правая панель). Мигрирующая трофобласть, хотя и выражает многие из тех же маркеров, что и экстра-villous trophoblast (EVT), не следует называть EVT, так как поколенческие структуры в плаценте не появились на этой очень ранней стадии развития.
Экспериментально мы смогли собрать небольшие КТБ и большие СТБ, которые легко различимы после того, как эмбрионы перевариваются в одиночные клетки на D8, D10 и D12(рисунок 2A,B). Мигрирующие трофибласты возникают на более поздних стадиях расширенной культуры эмбриона и могут быть собраны в D12 до энзиматического пищеварения всего эмбриона(рисунок 2A,B). Фенотипически отделяя эти три подлинии трофибласта до анализа одноклеточных клеток, мы можем определить конкретные транскриптомные маркеры и определить биологическую роль каждого типа клеток. Цитотрофобласт являются высоко пролиферативными и выступать в качестве прародителя клеток в поставке СТБ иМТБ дифференцированных линий 10,11,12,13. Syncytiotrophoblast участвуют в производстве плацентарный гормонов для поддержания беременности, а также может быть ответственным за эмбрионы рытьсяв эндометрия 10,11,12,13. Мигрирующая трофибласт имеет еще более сильные особенности инвазивного, миграционного фенотипа и, вероятно, отвечает за более глубокую и обширную колонизациюэндометрия матки 10,,11,,12,,13. После определения транскриптомной подписи каждого типа клеток, кластеризации анализы также выявили два дополнительных подмножества клеток, которые были морфологически неотличимы от CTB и транскриптомы с особенностями STB и MTB, соответственно12. Эти промежуточные клетки стадии, вероятно, в процессе дифференциации от CTB либо MTB или STB подлинажей и были бы упущены, если эмбрионы были слепо усваивается и клетки были разделены транскриптома в одиночку.
Протокол, описанный здесь, использует двухмерную (2D) культурную систему и не может быть оптимальным для поддержки трехмерного (3D) структурного развития, как это было предложено в недавней публикации, описывающей недавно разработанную систему 3Dкультуры 13. Тем не менее, в этой 2D системе дифференциация раннего трофибласта, кажется, согласуется с наблюдениями, сделанными из образцов in vivo14,,15,,16,,17. Этот протокол также может быть легко адаптирован для использования в недавно описанной системе 3D культуры13 с минимальными изменениями. Все шаги выполняются с помощью портативной микроманипуляционной пипетки с коммерчески доступными одноразовыми наконечниками или ротовой пипеткой из тонко вытянутой стеклянной пипетки, прикрепленной к резиновым трубам, фильтру и мундштуку.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработка протокола к культуре человеческих эмбрионов с помощью имплантации позволила ученым исследовать ранее неизведанное время вразработке 8,,9. Здесь мы используем расширенную культурную систему для культуры человеческих эмбрионов и изучаем ранн?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить многих пациентов в Колорадо Центр репродуктивной медицины (CCRM), которые любезно пожертвовал свои эмбрионы для исследований. Мы также хотели бы поблагодарить Карен Маруняк и клиническую лабораторию CCRM за помощь в обработке образцов ХГЧ, а также Сью Маккормик и ее клиническую команду эмбриологии ЭКО в CCRM за помощь в сборе, хранении, отслеживании и донорстве эмбрионов. Финансирование было предоставлено внутри ККРМ.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
