Peri-implantasyon Aşamasında Trophoblast Hücrelerinin Tek Hücre Li Hücre Koleksiyonu İnsan Embriyoları
Summary
Burada, vitrifiye insan blastosistlerinin ısınması, in vitro implantasyon dönemi boyunca ekinde, tek hücrelere sindirilmesi ve daha fazla araştırma için erken trofenlast hücrelerinin toplanması için bir yöntem tanımlıyoruz.
Abstract
İnsan implantasyonu, rahim yüzeyi epitelinin afipozve yapışıklığı ve blastosistin maternal decidua invazyonu, teknik ve etik sınırlamalar nedeniyle tarihsel olarak incelenmesi zor olan kritik ama esrarengiz bir biyolojik olaydır. İmplantasyon trophektoderm gelişimi ile erken trofoblast ve daha sonraki farklılaşma farklı trofoblast alt alt larına doğru başlatılır. Anormal erken trofoblast farklılaşması implantasyon yetmezliğine, plasental patolojilere, fetal anormalliklere ve düşüklere yol açabilir. Son zamanlarda insan embriyolarının, insanlarda implantasyon dönemini kapsayan bir zaman dilimi olan anne dokularının yokluğunda 13. Bu, araştırmacılara, anne etkilerini şaşırtmadan ve erken embriyo farklılaşma olaylarını in vivo’da incelemek için doğal engellerden kaçınmadan, bu kritik dönemde insan implantasyonunu araştırma ve trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini özetleme fırsatı vermiştir. İmplantasyon sırasında farklı trofoblast alt çizgilerini karakterize etmek için, mevcut iki boyutlu (2D) genişletilmiş kültür yöntemlerini benimsedik ve alt akım tahlilleri için farklı tipte trofenlast hücrelerini enzimatik olarak sindirmek ve izole etmek için bir prosedür geliştirdik. 2B koşullarda kültürlenen embriyolar göreceli olarak düzleştirilmiş morfolojiye sahiptir ve in vivo üç boyutlu (3D) embriyonik mimarilerin modelilmesinde suboptimal olabilir. Ancak, trophoblast farklılaşması, genişletilmiş kültür boyunca beklenen morfoloji ve gen ekspresyonu değişikliklerinden de anlaşıldığı gibi daha az etkilenmiş gibi görünmektedir. Sitotrophoblast, syncytiotrophoblast ve göçmen trofoblast ı da dahil olmak üzere farklı trofoblast alt ları boyut, yer ve zamansal doğuşile ayrılabilir ve daha fazla karakterizasyon veya deney için kullanılabilir. Bu erken trofenlast hücrelerinin araştırılması insan implantasyonunun anlaşılmasında, yaygın plasental patolojilerin tedavisinde ve gebelik kaybı nın görülme sıklığının azaltılmasında etkili olabilir.
Introduction
İnsan implantasyonu ve erken plasentanın ortaya çıkması tarihsel olarak araştırmak zordur ve büyük ölçüde bilinmemektedir çünkü gebelik klinik olarak saptanamayan bu aşamada insan dokularına erişilemez. Hayvan modelleri yetersizdir, çünkü insan plasentasyonu diğer öther memelilere göre kendine özgü özelliklere sahiptir. Örneğin, insan plasenta diğer hücreler rahim spiral arterler remodel ise bazı trofenlast hücreleri rahim miyometrium en az iç üçte ulaşan ile yaprak içine derinden işgal. Hatta en yakın evrimsel atalarımız, insan olmayan primatlar, plasental morfoloji ve trofenlast etkileşimleri maternal desidualdokular1,2,3ile farklılıklar göstermektedir. 1980’li yıllarda klinik insan in vitro fertilizasyon (IVF) kısırlık tedavisinde rutin bir uygulama olarak başlayana kadar in vitro pre-implantasyon insan embriyolarının in vitro elde edilmesi mümkün değildi4. Şimdi, insan blastosistleri transfer için daha uygun embriyoların seçimi için izin vermek için in vitro yetiştirilebilir, hem de güvenli genetik test sağlamak. Embriyo kültürü tekniklerinde iyileşme, hem de IVF artan kullanımı hastanın tedavi döngüleri tamamlandıktan sonra kalır birçok artı blastosistler vermiştir. Hastanın onayı, IRB onayı ve bazı kısıtlamalar ile bu blastosistler araştırma çalışmaları için kullanılabilir. Onlar insan embriyonik kök hücrelerin türevi için kullanılan paha biçilmez bir kaynak haline gelmiştir5, embriyonik kök hücrelere iç hücre kütlesinin geçiş anlayışı6,7, ve daha yakın zamanda, başarıyla güne kadar kültürlü olmuştur (D) 13 insanimplantasyonuremodel 8,9. Son zamanlarda geliştirilen tek hücreli omik yaklaşımlar kullanarak, Bu implantasyon aşamasında insan embriyo dokularına erişim daha önce10keşfetmek imkansız olan bu son derece dinamik hücre farklılaşma sürecini düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamak için benzersiz fırsatlar sunmuştur 10,11,12,13.
Burada, insan implantasyonu sırasında trophoblast farklılaşmasının dinamiklerini karakterize eden son yayınımızda kullanılan yöntemleri açıklıyoruz12. Bu protokol vitrifiye blastosistlerin ısınmasını, D12 sonrası IVF’ye kadar uzatılmış embriyo kültürünü, embriyonun tek hücrelere enzimatik sindirimini ve aşağı akım tahlilleri için hücre toplamayı içerir (Şekil 1). Bu genişletilmiş kültür sistemi anne girişi olmadan peri-implantasyon aşamasında insan embriyo gelişimini destekler ve yıllar önce histolojik örneklerden yapılan gözlemler ile tutarlı görünen trophoblast farklılaşması özetler14,15,16,17. İmplantasyon sırasında trofoblast popülasyonu en az iki hücre tipinden oluşur: mononükleli progenitor benzeri sitotrophoblast (CTB) ve ölümcül diferansiye, multinükleatlı sintiyotrophoblast (STB). Tripsin sindirimi üzerine, CTB morfolojik olarak diğer hücre soylarından ayırt edilemeyen küçük yuvarlak hücrelerdir(Şekil 2A, sol panel). CTB’nin epiblast ve ilkel endoderm gibi diğer hücre soylarından ayrılması, tek hücreli RNA dizilimi ile ortaya çıkan farklı transkripsiyon profilleri ile elde edilebilir. Syncytiotrophoblast hücreleri kolayca diğer hücre tiplerinden önemli ölçüde daha büyük ve esas olarak embriyo nun çevresinde bulunan düzensiz şekilli yapılar olarak tanımlanabilir (Şekil 2A, orta panel; Şekil 2B, sol panel). Göçmen trofoblast hücreleri (MTB) embriyo genişletilmiş kültür sırasında bulunan başka bir trofoblast alt çizgi ve görünüşte embriyoana gövdesinden hareket olarak kabul edilebilir(Şekil 2A, sağ panel, Şekil 2B, sağ panel). Göçmen trofoblast, ekstra villous trofoblast (EVT) ile aynı belirteçlerin çoğunu ifade etmesine rağmen, plasentadaki villous yapılar gelişmenin bu çok erken evresinde ortaya çıkmadığından, EVT olarak adlandırılmamalıdır.
Deneysel olarak, embriyolar D8, D10 ve D12’de tek hücrelere sindirildikten sonra kolayca ayırt edilebilen küçük CTB ve büyük STB’yi toplayabildik(Şekil 2A,B). Göçmen trofoblastlar genişletilmiş embriyo kültürünün ileri evrelerinde ortaya çıkar ve tüm embriyonun enzimatik sindiriminden önce D12’de toplanabilir(Şekil 2A,B). Bu üç trofoblast alt çizgisini tek hücre analizinden önce fenotipik olarak ayırarak, spesifik transkripsiyonel belirteçleri ve her hücre türünün biyolojik rolünü tanımlayabiliriz. Sitotrophoblast son derece proliferatif ve STB ve MTB farklılaştırılmış soy10,11,,12,13temininde progenitor hücreleri olarak hareket. Syncytiotrophoblast gebelik korumak için plasental hormonlar üretiminde yer alan ve aynı zamanda endometrium içine oyuk embriyolar sorumlu olabilir10,11,12,13. Göçmen trofoblast bir invaziv, göçmen fenotip daha güçlü özelliklere sahiptir ve muhtemelen rahim endometrium10,11,,12,13daha derin ve daha geniş kolonizasyon sorumludur. Her hücre tipinin transkripsiyon analizi, her hücre tipinin transkripsiyon izini tanımladıktan sonra, ctb’den morfolojik olarak ayırt edilemeyen ve sırasıyla12′de STB ve MTB özelliklerine sahip transkripsiyonlara sahip iki ek hücre alt kümesini ortaya çıkarmış bulunmaktadır. Bu ara evre hücreler, CTB’den MTB veya STB alt geçitlerine ayırt etme sürecinde dir ve embriyolar körü körüne sindirilseydi ve hücreler tek başına transkripsiyonla ayrılsaydı gözden kaçırılırlardı.
Burada açıklanan protokol iki boyutlu (2D) kültür sistemi kullanır ve yeni geliştirilen 3D kültür sistemi13açıklayan yeni bir yayın tarafından önerilen üç boyutlu (3D) yapısal gelişimi desteklemek için en uygun olmayabilir. Yine de, bu 2D sistemde erken trofoblast farklılaşması in vivo örnekleri14,15,,16,17yapılan gözlemler ile tutarlı gibi görünüyor. Bu protokol, en az değişiklikle en son tanımlanan 3B kültür sistemi13’teki kullanıma da kolayca uyarlanabilir. Tüm adımlar, ticari olarak kullanılabilen tek kullanımlık uçlar veya kauçuk boru, filtre ve ağızlık bağlı ince çekilmiş cam pipet bir ağız pipet ile bir el mikromanipülasyon pipet ile gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Implantasyon yoluyla kültür insan embriyoları için protokolün geliştirilmesi bilim adamları geliştirme daha önce keşfedilmemiş bir zaman keşfetmek için izin verdi8,9. Burada, insan embriyolarını kültürlendirmek ve villous plasenta oluşumundan önce erken trofoblast farklılaşmasını incelemek için genişletilmiş bir kültür sistemi kullanıyoruz. Burada açıklanan yöntemler, tek hücreli alt akış analizinde kullanılmak üzere farklı T…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Colorado Üreme Tıbbı Merkezi’ndeki (CCRM) embriyolarını nazikçe araştırma için bağışlayan birçok hastaya teşekkür etmek istiyoruz. Biz de Karen Maruniak ve CCRM klinik laboratuvar hCG örnekleri işleme yardımları için teşekkür etmek istiyorum, yanı sıra Sue McCormick ve CCRM onun klinik IVF embriyoloji ekibi embriyo toplama, depolama, izleme ve bağış ile yardım için. Finansman ccrm tarafından dahili olarak sağlanmıştır.
Materials
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation–a review. Placenta. , 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion — a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O’Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O’Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
