RNA-interferens är en allmänt tillämplig, kraftfull teknik för att manipulera genuttryck i specifika utvecklingsstadier. Här beskriver vi de nödvändiga stegen för att genomföra denna teknik i vattenlevande dykning skalbaggen Thermonectus marmoratus, från förvärv av gensekvenser till knockdown av gener som påverkar struktur eller beteende.
RNA-interferens (RNAi) är fortfarande en kraftfull teknik som möjliggör riktad minskning av genuttryck genom mRNA-nedbrytning. Denna teknik är tillämplig på en mängd olika organismer och är mycket effektiv i den artrika ordningen Coleoptera (skalbaggar). Här sammanfattar vi de nödvändiga stegen för att utveckla denna teknik i en ny organism och illustrera dess tillämpning på de olika utvecklingsstadier av vattenlevande dykning skalbagge Thermonectus marmoratus. Målgensekvenser kan erhållas kostnadseffektivt genom montering av transkriptomer mot en nära släkting med känd genomik eller de novo. Kandidat gen kloning utnyttjar en specifik kloning vektor (pCR4-TOPO plasmid), som gör det möjligt att syntesen av dubbelsträngad RNA (dsRNA) för någon gen med användning av en enda gemensam primer. Det syntetiserade dsRNA kan injiceras i antingen embryon för tidiga utvecklingsprocesser eller larver för senare utvecklingsprocesser. Vi illustrerar sedan hur RNAi kan injiceras i vattenlevande larver med hjälp av immobilisering i agaros. För att demonstrera tekniken, ger vi flera exempel på RNAi experiment, generera specifika knockdowns med förutsagda fenotyper. Specifikt leder RNAi för garvning genen laccase2 till nagelband ljusare i både larver och vuxna, och RNAi för ögat pigmentering genen vit producerar en ljusare / brist på pigmentering i ögonrör. Dessutom leder knockdown av en nyckellinsprotein till larver med optiska brister och en minskad förmåga att jaga byte. Kombinerat, dessa resultat exemplifierar kraften i RNAi som ett verktyg för att undersöka både morfologiska mönster och beteendemässiga drag i organismer med endast transkriptomic databaser.
Frågan om hur specifika gener bidrar till utvecklingen av olika egenskaper är ett spännande ämne inom biologin. Under de senaste decennierna har stora framsteg gjorts när det gäller dissekera den genetiska underbyggnad av utvecklingsprocesser i ett fåtal modell organismer, såsom nematoden Caenorhabditis elegans, fruktflugan Drosophila melanogaster, och huset mus Mus musculus1. På senare tid har uppfinningen av kraftfulla gen-redigering tekniker såsom klustrade regelbundet interspaced korta palindromic upprepar (CRISPR)/Cas92 har gett möjlighet att ändra den genetiska koden för icke-modell organismer (för exempel se3,4). Som ett resultat har det skett en ökning av genetiska studier på en mängd olika organismer som inte tidigare hade kontaktats genom molekylära tekniker. Med tanke på den enorma mångfalden i vårt djurrike, med många intressanta egenskaper eller dragvarianser som bara är representerade i specifika arter, har dessa framsteg gjort det till en spännande tid för evolutionär-utvecklingsbiologi (“evo-devo”) relaterat arbete. Men genomredigeringstekniker som är tillgängliga för icke-modellorganismer är relativt begränsade när det gäller de utvecklingstidspunkter som de kan tillämpas på, vilket gör det utmanande att urskilja de tidsmässiga egenskaper som är relaterade till den roll som specifika gener spelar i något drag. Dessutom är transgena tekniker ofta begränsade till gener som inte är väsentliga för överlevnad (dvs. vars knockout inte resulterar i dödlighet). Därför, medan gen-redigering tekniker har börjat bli populär, det finns fortfarande ett behov av effektiva tekniker som är tillämpliga på en mängd olika organismer vid specifika utvecklingsmässiga tidpunkter och underlätta partiella knockdowns (snarare än fullständig förlust-of-funktion). Här uppmärksammar vi RNA-interferens (RNAi), en något daterad men ändå kraftfull gennedslagsteknik5 som är särskilt värdefull som en synergistisk inställning till genredigering. Specifikt utvecklade vi förfaranden som möjliggör tillämpning av RNAi på vattenlevande dykarbaggar som ett exempel som illustrerar genomförandet av denna teknik, från förvärv av de nödvändiga molekylära sekvenserna till en framgångsrik injektion av dubbelsträngat RNA (dsRNA) i ägg och larver.
RNAi-baserade gen knockdown utnyttjar en medfödd försvarsmekanism av organismer, där dsRNA molekyler underlätta tysta invaderande nukleinsyra sekvenser, såsom virus och transposoner6. I korthet tas dsRNA upp i cellen, där det skärs i 20–25 nukleotidstycken av Dicer-enzymet. Dessa bitar aktiverar sedan bildandet av det RNA-inducerade ljuddämpningskomplexet (RISC), vilket hämmar det riktade mRNA genom att binda till det på specifika platser med hjälp av guidesträngen. Denna process leder slutligen till mRNA nedbrytning och därmed stör översättningen av mRNA i respektive protein6. Den RNAi-baserade genen knockdown teknik som presenteras här förlitar sig därför på injektion av dsRNA. För djurmodeller utvecklades ursprungligen denna teknik i C. elegans7 och D. melanogaster8 men har sedan dess framträtt som ett kraftfullt funktionellt genetiskt verktyg i icke-modellorganismer9,10. På grund av sin mycket effektiva natur i vissa insekter, RNAi kan även tillämpas i skadedjursbekämpning11.
Som forskningsverktyg har RNAi använts för att undersöka hur viktiga molekylär-utvecklingsmässiga vägar fungerar i icke-traditionella insektsmodeller. Till exempel har RNAi i mjölbaggen Tribolium castaneum varit avgörande för att bestämma hur djupt bevarade gener bidrar till specifika egenskaper i att skalbagge, som exemplifieras för utveckling av specifikt formade vingar12,13,14 och ögon15,16. De tekniker som ligger till grund för manipulationerna i T. castaneum har beskrivitsväl 17 och förlitar sig på förmågan att immobilisera relativt torra ägg och larver på en klibbig yta. Sådan immobilisering är dock inte möjligt för de våta utvecklingsmässiga former av vattenlevande organismer som Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Som är fallet för många icke-traditionella modell organismer, saknar det en kommenterad arvsmassa. För att manipulera genuttryck i någon organism utan ett genom, är ett rimligt och kostnadseffektivt första steg att generera transkriptomer och identifiera de förmodade nukleotidsekvenserna av de uttryckta gener av intresse baserat på sekvenslikhet med relaterade men mer etablerade modellorganismer, i detta fall främst Tribolium (Coleoptera) och Drosophila gener.
Här, för att visa hur RNAi kan användas på en vattenlevande organism, diskuterar vi först protokoll och programvara för RNA extraktion och transkriptom generation och assemblage, som möjliggör identifiering av specifika riktade gensekvenser. Vi sammanfattar sedan nödvändiga steg för syntetisera genspecifika dsRNA. Därefter illustrerar vi hur ägg kan injiceras i en vattenmiljö och visa inkubation protokoll för odling utveckla embryon. Dessutom visar vi hur agarosgel kan användas för att helt immobilisera larver under injektionsprocessen, en teknik som i allmänhet är användbar under olika förfaranden och som skulle kunna appliceras på en mängd olika leddjur. För att visa hur RNAi kan appliceras på olika utvecklingsstadier, inkluderar vi ett exempel där vi tystade ögonpigmen vit i embryon. Dessutom beskriver vi ett exempel där garvning genen laccase2(lac2) tystades under både den andra larval instar (att påverka larver av den tredje larval instar) och den tredje larval instar (att påverka vuxna). Slutligen visar vi att injektionen av en lägre koncentration av dsRNA leder till partiell knockdown, vilket visar att denna teknik också kan tillämpas på gener där förlust-of-funktion är känt för att vara dödliga.
Vårt mål är att denna sammanställning av metoder kommer att göra RNAi allmänt tillgänglig, särskilt som detta verktyg förblir en kraftfull synergistisk teknik till CRISPR/Cas9-baserad genredigering, med fördelen att den kan tillämpas på de önskade utvecklingsstadierna av studerade organismer. För att exemplifiera denna styrka injicerade vi dsRNA i embryon och i olika larvstadium. Injektioner i ägg påverkade utvecklingen av embryon (Figur 2), injektioner i det andra larvstadiet hade uppenbara effekter på det tredje larvstadiet (Figur 4 och Figur 6), och injektioner i det tredje larvstadiet visade effekter hos de vuxna (Figur 5). Medan den exakta tidpunkten måste fastställas experimentellt, i allmänhet, injektioner träda i kraft inom några dagar. Framgången för denna process kan påverkas av längden på dsRNA-sekvensen. Här presenterade vi exempel med lite över 200 bp till mer än 800 bp. Som en allmän regel, sekvenser mellan 100 och 600 bp är att föredra att begränsa off-target effekter, men sekvenser upp till 1000 bp ge goda resultat22. En fråga när det gäller RNAi är varaktigheten av knockdown som kan uppnås genom denna teknik. Eftersom fenotyperna var terminal i varje steg, kan vi inte kommentera denna fråga baserat på våra presenterade resultat. Det har dock tidigare noterats att RNAi effekter är i allmänhet relativt långlivade, och att högre koncentrationer leder till längre varaktiga nedslagningar20.
En begränsning av denna teknik är att det fungerar bättre för vissa organismer än för andra, och det verkar inte finnas något direkt sätt att förutsäga hur bra det kommer att fungera a priori. Ändå har det visat sig fungera bra för ett stort utbud av olika organismer. Inom leddjur, detta inkluderar arachnids26, kräftdjur27, och en mängd olika insekter, med särskilt hög framgång i skalbaggar28. Ytterligare en komplikation är att skillnader i fenotyp svårighetsgrad ofta förekommer mellan individer trots tillämpningen av samma mängd dsRNA. Som illustreras i figur 2B, variation kan även förekomma inom en individ. I våra RNAi studier som riktar sig mot olika gener som är involverade i T. marmoratus larval eye utveckling, har vi ofta funnit att vissa ögon påverkas mer allvarligt än andra. Detta fenomen kan vara relaterade till den relativt täta vävnaden i ögat klustret, med dsRNA bättre kunna nå några av enheterna.
För ett framgångsrikt utförande av RNAi-experiment är det kritiskt att flera parametrar är optimerade för målgenen. Till exempel kan koncentrationen av dsRNA och längden på den riktade genen starkt påverka resultatet20. En annan kritisk parameter är hur injektionerna utförs, eftersom denna process i hög grad kan påverka överlevnadsgraden. För embryon uppnådde vi bästa resultat genom att rikta in sig på embryots centrum. En vällagd platta möjliggör injektion av 100 eller fler embryon i en enda session. För larver är det avgörande att sätta in injektionsnålen mellan segmenten. Dessa injektioner kräver mer dsRNA, och baserat på larver tillgänglighet, vår injektion uppsättningar här vanligtvis bara bestod av ett fåtal djur i taget. För alla injektioner är det avgörande att förhindra att luft kommer in i organismen.
I vissa fall kan återkopplingsslingorna i ett genreglerande nätverk och genetisk redundans påverka RNAi-fenotypernas penetrance, trots konsekventa knockdowns. Detta verkar vara fallet för våra beteendemässiga observationer av larver med mycket framgångsrika knockdowns av en framträdande lins protein, Lens318. Även om vi kontrollerade den höga effektiviteten av dessa knockdowns genom qPCR, observerades avsevärd variation i de associerade fenotyper. Detta resultat belyser behovet av korrekt kvantifiera RNAi knockdowns (för detaljer om alternativ se22). Om det inte finns någon tydlig a priori förväntan när det gäller de resulterande fenotyper, ett bra sätt att kontrollera för off-target effekterna av RNAi är att rikta samma gen med två icke-överlappande sekvenser av dsRNA och att utvärdera resultaten för vanliga fenotyper.
I motsats till genredigeringstekniker är RNAi också ett kraftfullt verktyg för att studera dödliga gener, och det finns två sätt att göra det på. Till exempel, om man är intresserad av det funktionella bidraget från en gen där förlust-of-funktion tidigt i utvecklingen är känd för att vara dödlig, en funktionell undersökning av en sådan gen kan uppnås genom att helt enkelt låta djuret utvecklas normalt och sedan slå ner genen via RNAi senare i utvecklingen (dvs. i den vuxna). Alternativt kan en gen där fullständig förlust-of-funktion är känd för att vara dödlig undersökas genom en partiell knockdown, vilket kan uppnås genom att injicera en rad dsRNA koncentrationer. Några av våra resultat visar knockdowns av lac2, som är kända för att vara dödliga om nagelbanden i insekter blir alltför mjuk24. Även lac2 RNAi skalbagge avbildas i figur 5 skulle vara osannolikt att överleva utanför laboratorieförhållanden. En annan dödlig gen skärs, som koder för en transkriptionsfaktor som är grundläggande för cell-öde specifikation i olika organsystem i leddjur och har kopplats till GLIA utveckling i Drosophila visuella systemet29. Baserat på vår erfarenhet med skära RNAi i T. marmoratus embryon, kan vi framkalla informativa öga fenotyper i embryon som har möjlighet att slutföra sina embryonala ögon utveckling (opublicerade observationer). Här, högre doser verkar leda till högre dödlighet priser, medan lägre doser resulterar i observerbara och informativa fenotyper.
Vårt protokoll inte bara listar de nödvändiga stegen för en forskare att fullfölja RNAi experiment på T. marmoratus, som illustreras, men är också allmänt tillämplig på andra organismer, särskilt vattenlevande organismer. Bland vattenlevande organismer finns det redan flera exempel inom kräftdjur som vattenlopporna Daphnia30 och räkor (för en nyligen genomgång, se hänvisning31). Det finns gott om möjligheter bland vattenlevande insekter, eftersom de har uppskattats omfatta cirka 6% av all insektsmångfald, med sannolikt mer än 200.000 arter32. Vidare har RNAi redan utförts på vattenstrids som tenderar att bebo ytan av vattenmiljöer33. Om ingen arvsmassa är närvarande, då en transkriptom kan monteras de novo. Så länge denna process avslöjar contigs av några hundra nukleotider, kan dsRNA mot specifika gener utformas. Vårt protokoll för immobiliserande insekter i agaros kommer sannolikt också att vara användbart för andra förfaranden, särskilt för mjuka, formbara och vattenlevande organismer. Sammantaget är RNAi fortfarande en kraftfull teknik för att manipulera genuttryck i en mångsidig grupp av organismer, även när inga andra molekylära och genetiska verktyg finns tillgängliga.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Josh Benoit för hans hjälp med bioinformatik Hailey Tobler för hennes hjälp med att höja Sunburst Diving Beetles och Tamara Pace för redaktionell hjälp. Denna forskning stöddes av National Science Foundation under bidrag IOS-1456757 och IOS-1856341 till EKB och IOS1557936 till YT.
1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
injection buffer (10x) | See section 4 | ||
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |