Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs
Summary
La rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) peut être utilisée pour modéliser les maladies rétiniennes ischémiques telles que la rétinopathie de la prématurité et la rétinopathie diabétique proliférative et pour servir de modèle pour des études de preuve de concept dans l’évaluation des médicaments antiangiogéniques pour les maladies néovasculaires. OIR induit une néovascularisation robuste et reproductible dans la rétine qui peut être quantifiée.
Abstract
Un des modèles couramment utilisés pour les rétinopathies ischémiques est le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour l’induction du modèle OIR et ses readouts chez les souris et les rats. La néovascularisation rétinienne est induite dans l’OIR en exposant les petits rongeurs soit à l’hyperoxie (souris) soit en alternant les niveaux d’hyperoxie et d’hypoxie (rats). Les principales lectures de ces modèles sont la taille des zones néovasculaires (NV) et avasculaires (AVA) dans la rétine. Ce modèle in vivo préclinique peut être utilisé pour évaluer l’efficacité des médicaments anti-angiogéniques potentiels ou pour aborder le rôle de gènes spécifiques dans l’angiogenèse rétinienne en utilisant des animaux génétiquement manipulés. Le modèle a une certaine tension et la variation spécifique du fournisseur dans l’induction OIR qui doit être pris en considération lors de la conception des expériences.
Introduction
Des modèles expérimentaux fiables et reproductibles sont nécessaires pour étudier la pathologie derrière les maladies oculaires angiogéniques et pour développer de nouvelles thérapeutiques à ces maladies dévastatrices. L’angiogenèse pathologique est la marque de fabrique de la dégénérescence maculaire liée à l’âge humide (DMLA) et de nombreuses maladies rétiniennes ischémiques dont la rétinopathie de la prématurité (ROP), la rétinopathie diabétique proliférante (DP) et l’occlusion rétinienne des veines (RVO)1,2,3,4. Les rétines humaines et rongeurs suivent un modèle de développement similaire, car la rétine humaine et la rétine des rongeurs sont parmi les derniers tissus vascularisés. Avant que la vascularisation rétinienne se soit complètement développée, la rétine reçoit son approvisionnement en éléments nutritifs de la vascularisation hyaloïde, qui, à son tour, régresse lorsque la vascularisation rétiniennecommence à se développer 1,2. Chez l’homme, le développement vasculaire rétinien est achevé avant la naissance, tandis que chez les rongeurs la croissance de la vascularisation rétinienne se produit après la naissance. Puisque le développement vasculaire rétinien se produit postnatally chez les rongeurs, il fournit un système modèle idéal pour étudier l’angiogenèse2,3. Les rongeurs nouveau-nés ont une rétine avasculaire qui se développe progressivement jusqu’à ce que le développement complet de la rétine vasculaire soit atteint à la fin de la troisième semainepostnatale 4. Les vaisseaux sanguins croissants de la souris néonatale sont en plastique, et ils subissent une régression pendant le stimulus hyperoxie5.
Rop est la principale cause de cécité infantile dans les pays occidentaux, car il affecte près de 70% des prématurés ayant un poids à la naissance de moins de 1250 g6,7. Le ROP survient chez les prématurés nés avant que les vaisseaux rétiniens ne terminent leur croissance normale. Rop progresse en deux phases: dans la phase I, la naissance prématurée retarde la croissance vasculaire rétinienne où, après la phase II, la vascularisation inachevée de la rétine en développement provoque l’hypoxie, ce qui induit l’expression de facteurs de croissance angiogéniques qui stimulent la croissance nouvelle et anormale des vaisseauxsanguins 8. Le modèle OIR a été un modèle largement utilisé pour étudier la pathophysiologie du ROP et d’autres rétinopathies ischémiques ainsi que pour tester de nouveaux candidatsmédicaments 2,3,9. Il est largement considéré comme un modèle reproductible pour la réalisation d’études de preuve de concept pour les médicaments antiangiogéniques potentiels pour les maladies oculaires ainsi que non oculaires. Les deux modèles de rongeurs, c’est-à-dire la souris et le rat OIR diffèrent dans leur modèle d’induction et de phénotype de la maladie. Le modèle de rat imite le phénotype ROP avec plus de précision, mais le modèle de souris fournit un modèle plus robuste, rapide et reproductible pour la néovascularisation rétinienne (NV). Dans le modèle de souris, NV se développe à la rétine centrale. Cette lecture pathologique est importante dans les études pharmacologiques d’efficacité pour de nombreuses rétinopathies ischémiques, telles que la RDP, le VR et la DMR exsudative, ainsi que pour les maladies angiogéniques non oculaires comme le cancer. En outre, la disponibilité de souris génétiquement manipulées (transgéniques et knockout) fait du modèle OIR souris une option plus populaire. Cependant, ni la souris ni le rat OIR modèle crée la fibrose rétinienne, qui est typique dans les maladies humaines.
La compréhension que des niveaux élevés d’oxygène contribuent au développement du ROP dans les années1950 10,11 a conduit au développement de modèles animaux. Les premières études sur l’effet de l’oxygène sur la vascularisation rétinienne ont été faites en 195012,13,14 et jusqu’aux années 1990, il y avait beaucoup de raffinements au modèle OIR. Les recherches menées par Smith et coll. en 1994 ont établi une norme pour le modèle actuel d’OIR de souris qui sépare l’hyaloidopathy de la rétinopathie15. Une large adoption de la méthode pour quantifier la vaso-oblitération et la NV pathologique par Connor et coll. (2009) a encore accru sa popularité16. Dans ce modèle, les souris sont placées à 75% d’oxygène (O2) pendant 5 jours à P7, suivies de 5 jours dans des conditions normoxiques. L’hyperoxie de P7 à P12 provoque une régression de la vascularisation rétinienne dans la rétine centrale. Au retour aux conditions normoxiques, la rétine avasculaire devient hypoxique (Figure 1A). En raison des stimulus hypoxiques de la rétine centrale avasculaire, certains des vaisseaux sanguins rétiniens poussent vers le vitré, formant le NV preretinal, appelé touffes préretinales2,3. Ces touffes sont immatures et hyperpermérables. La quantité de NV culmine à P17, après quoi elle régresse. La rétine est entièrement revascularisée et le NV est complètement régressé par P23 – P25 (Figure 2A)2,3.
Le modèle rat OIR (utilisant différents niveaux d’O2) a été décrit pour la première fois dans les années 1990 montrant que les différents niveauxd’O 2 à 80% et 40% causent un NV plus prononcé que moins de 80% O2 exposition constante17. Plus tard, il a été découvert que le modèle d’hypoxie intermittente, où O2 est pédalé à partir de l’hyperoxie (50%) l’hypoxie (10-12 %), provoque encore plus de NV que le modèle O 218à 80/40 %. Dans le modèle 50/10%, les chiots rat sont exposés à 50% pendant 24 heures, suivis de 24 heures dans 10% O2. Ces cycles se poursuivent jusqu’au P14, lorsque les chiots rat sont retournés à des conditions normoxiques (figure 1B). Comme chez les patients humains de ROP, dans le modèle de rat les secteurs avasculaires se développent à la périphérie de la rétine en raison du plexus vasculaire rétinien immature (figure 3).
Dans les deux modèles, les principaux paramètres qui sont habituellement quantifiés sont la taille d’AVA et de NV. Ces paramètres sont généralement analysés à partir de supports plats rétiniens où les cellules endothéliales sontétiquetées 4,16. Auparavant, la quantité de NV préretinal a été évaluée à partir de sections transversales rétiniennes en comptant les noyaux de vaisseaux sanguins ou de cellules vasculaires s’étendant à vitreux au-dessus de la membrane limitante interne. La principale limite de cette approche est qu’il n’est pas possible de quantifier les AGA.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sévérité du phénotype de la maladie dépend à la fois de la souche et même du fournisseur dans les modèles OIR souris et rat23. Ceci suggère qu’il y ait une grande variabilité génotypique dans le développement pathologique. En général, les rongeurs pigmentés développent un phénotype plus grave que les rongeurs albinos. Par exemple, la vascularisation rétinienne de l’albinos BALB/c se revascularise rapidement après l’hyperoxie et ne développe pas de NVd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen et Anne Kankkunen pour leur excellent soutien technique. Ces travaux ont été financés par l’Académie de Finlande, la Fondation Päivikki et Sakari Sohlberg, la Tampere Tuberculosis Foundation, la Fondation médicale finlandaise, la Pirkanmaa Hospital District Research Foundation et le Tampere University Hospital Research Fund.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
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