Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren
Summary
Die sauerstoffinduzierte Retinopathie (OIR) kann verwendet werden, um ischämische Netzhauterkrankungen wie Retinopathie der Frühreife und proliferative diabetische Retinopathie zu modellieren und als Modell für Proof-of-Concept-Studien zur Bewertung antiangiogener Medikamente für neovaskuläre Erkrankungen zu dienen. OIR induziert eine robuste und reproduzierbare Neovaskularisation in der Netzhaut, die quantifiziert werden kann.
Abstract
Eines der am häufigsten verwendeten Modelle für ischämische Retinopathien ist das sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell (OIR). Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für die INduktion des OIR-Modells und deren Auslesungen bei Mäusen und Ratten. Die retinale Neovaskularisation wird in OIR induziert, indem Nagetierwelpen entweder Hyperoxia (Mäuse) oder abwechselnden Hyperoxia- und Hypoxie-Werten (Ratten) aussetzen. Die primären Auslesungen dieser Modelle sind die Größe der neovaskulären (NV) und avaskulären (AVA) Bereiche in der Netzhaut. Dieses präklinische In-vivo-Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit potenzieller antiangiogener Medikamente zu bewerten oder um die Rolle bestimmter Gene in der retinalen Angiogenese durch den Einsatz genetisch manipulierter Tiere zu thematisieren. Das Modell weist eine gewisse Belastungs- und herstellerspezifische Variation in der OIR-Induktion auf, die bei der Gestaltung der Experimente berücksichtigt werden sollte.
Introduction
Zuverlässige und reproduzierbare experimentelle Modelle sind erforderlich, um die Pathologie hinter angiogenen Augenerkrankungen zu untersuchen und neue Therapeutika für diese verheerenden Krankheiten zu entwickeln. Die pathologische Angiogenese ist das Kennzeichen für die nasse altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und für viele ischämische Netzhauterkrankungen, darunter Retinopathie der Frühreife (ROP), proliferative diabetische Retinopathie (PDR) und Netzhautvenenverschluss (RVO)1,2,3,4. Menschliche und Nagetier Netzhaut folgen einem ähnlichen Muster der Entwicklung, da sowohl menschliche und Nagetier Netzhaut gehören zu den letzten Geweben, die vaskularisiert werden. Bevor sich die Netzhautvaskulatur vollständig entwickelt hat, erhält die Netzhaut ihre Nährstoffzufuhr aus der hyaloiden Vaskulatur, die wiederum nachlässt, wenn die Netzhautvaskulatur beginnt,1,2zu entwickeln. Bei der menschlichen, retinalen Gefäßentwicklung wird vor der Geburt abgeschlossen, während bei Nagetieren das Wachstum der netzretinalen Vaskulatur nach der Geburt auftritt. Da die retinale Gefäßentwicklung postnatal bei Nagetieren auftritt, bietet sie ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese2,3zu untersuchen. Die neugeborenen Nagetiere haben eine avaskuläre Netzhaut, die sich allmählich entwickelt, bis die vollständige vaskuläre Netzhautentwicklung bis zum Ende der dritten postnatalen Woche4erreicht ist. Die wachsenden Blutgefäße der neonatalen Maus sind plastisch, und sie durchlaufen Regression während Hyperoxia Stimulus5.
ROP ist die Hauptursache für Kinderblindheit in westlichen Ländern, da es fast 70% der Frühgeborenen mit Geburtsgewicht unter 1.250 g6,7betrifft. ROP tritt bei Frühgeborenen auf, die geboren werden, bevor Netzhautgefäße ihr normales Wachstum vollenden. ROP schreitet in zwei Phasen voran: In Phase I verzögert die Frühgeburt das retinale Gefäßwachstum, wobei nach Phase II die unvollendete Vaskularisation der sich entwickelnden Netzhaut Hypoxie verursacht, die die Expression angiogener Wachstumsfaktoren induziert, die das Wachstum neuer und abnormaler Blutgefäße stimulieren8. Das OIR-Modell ist ein weit verbreitetes Modell, um die Pathophysiologie von ROP und anderen ischämischen Retinopathien zu studieren sowie neuartige Wirkstoffkandidaten2,3,9zu testen. Es wird weithin als reproduzierbares Modell für die Durchführung von Proof-of-Concept-Studien für potenzielle antiangiogene Medikamente für Augen- und Nicht-Augenerkrankungen angesehen. Die beiden Nagetiermodelle, d.h. Maus und Ratte OIR unterscheiden sich in ihrem Modell Induktion und Krankheit Phänotyp. Das Rattenmodell imitiert den ROP-Phänotyp genauer, aber das Mausmodell bietet ein robusteres, schnelleres und reproduzierbareres Modell für die retinale Neovaskularisation (NV). Im Mausmodell entwickelt sich NV zur zentralen Netzhaut. Diese pathologische Auslesung ist wichtig in pharmakologischen Wirksamkeitsstudien für viele ischämische Retinopathien, wie PDR, RV und exsudative AMD sowie für nicht-okuläre, angiogene Erkrankungen wie Krebs. Darüber hinaus macht die Verfügbarkeit von genetisch manipulierten (transgenen und Knockout) Mäusen das Maus-OIR-Modell zu einer beliebteren Option. Allerdings erzeugt weder das OIR-Modell der Maus noch der Ratte eine Netzhautfibrose, die typisch für menschliche Krankheiten ist.
Das Verständnis, dass ein hoher Sauerstoffgehalt zur Entwicklung von ROP in den 1950er Jahren10,11 führte zur Entwicklung von Tiermodellen. Die ersten Studien über die Wirkung von Sauerstoff auf die Netzhautvaskulatur wurden 195012,13,14 durchgeführt und bis in die 1990er Jahre gab es viele Verfeinerungen des OIR-Modells. Die Forschung von Smith et al. im Jahr 1994 setzte einen Standard für das aktuelle Maus-OIR-Modell, das Hyaloidopathie von Retinopathietrennt 15. Eine breite Anwendung der Methode zur Quantifizierung von Vaso-Obliteration und pathologischer NV durch Connor et al. (2009) steigerte seine Popularitätweiter 16. In diesem Modell werden Mäuse bei 75% Sauerstoff (O2) für 5 Tage bei P7 platziert, gefolgt von 5 Tagen unter normoxischen Bedingungen. Hyperoxia von P7 bis P12 bewirkt, dass die Netzhautvaskulatur in der zentralen Netzhaut zurückgeht. Nach der Rückkehr zu normoxischen Bedingungen wird die avaskuläre Netzhaut hypoxisch (Abbildung 1A). Aufgrund der hypoxischen Reize der avaskulären zentralen Netzhaut sprießen einige der retinalen Blutgefäße in Richtung des Glaskörpers und bilden präretinale NV, sogenannte präretinale Büschel2,3. Diese Büschel sind unreif und hyperpermeable. Die NV-Spitzenmenge bei P17, danach geht sie zurück. Die Netzhaut ist vollständig reaskularisiert und NV wird vollständig durch P23 – P25 (Abbildung 2A)2,3zurückgedrängt.
Das OIR-Modell der Ratte (mit unterschiedlichenO2-Werten)wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben und zeigte, dass unterschiedlicheO2-Werte bei 80 % und 40 % eine ausgeprägtere NV verursachen als unter 80 %O2 konstante Exposition17. Später wurde entdeckt, dass das intermittierende Hypoxie-Modell, bei demO2 aus Hyperoxia (50%) Hypoxie (10-12 %), verursacht noch mehr NV als das 80/40% O2 Modell18. Im 50/10%-Modell sind Rattenwelpen 20 % lang 50 % ausgesetzt, gefolgt von 24 Stunden in 10 % O2. Diese Zyklen werden bis P14 fortgesetzt, wenn die Rattenwelpen an normoxische Bedingungen zurückgegeben werden (Abbildung 1B). Wie bei menschlichen ROP-Patienten entwickeln sich im Rattenmodell die avaskulären Bereiche aufgrund eines unreifen retinalen Gefäßplexus zur Peripherie der Netzhaut (Abbildung 3).
In beiden Modellen sind die Hauptparameter, die normalerweise quantifiziert werden, die Größe von AVA und NV. Diese Parameter werden in der Regel von retinalen flachen Halterungen analysiert, wo die Endothelzellen mit4,16beschriftet sind. Zuvor wurde die Menge an präretinalen NV aus Netzhautquerschnitten durch Zählen von Blutgefäß- oder Gefäßzellkernen, die sich über der inneren grenzenden Membran bis hin zu Glaskörpern ausdehnten, ausgewertet. Die Hauptbeschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass es nicht möglich ist, die AVAs zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Schwere des Krankheitsphänotyps hängt sowohl vom Stamm als auch vom Anbieter sowohl in den MOper- als auch in der Muhr der OIR-Modelle23ab. Dies deutet darauf hin, dass es eine breite genotypische Variabilität in der Pathologieentwicklung gibt. Im Allgemeinen entwickeln pigmentierte Nagetiere einen schwereren Phänotyp als die Albino-Nagetiere. Zum Beispiel, die netzhautvaskulatur von albino BALB/c revaskularisiert schnell nach Hyperoxien und entwickelt nV überhaupt nicht…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen und Anne Kankkunen für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Akademie Finnlands, der Päivikki and Sakari Sohlberg Foundation, der Tampere Tuberculosis Foundation, der Finnischen Medizinischen Stiftung, der Pirkanmaa Hospital District Research Foundation und dem Tampere University Hospital Research Fund finanziert.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
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