מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים
Summary
רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) יכולה לשמש למודל מחלות רשתית איסכמיות כגון רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת ולשמש כמודל למחקרים הוכחת הרעיון בהערכת תרופות אנטי אנגיוגניות למחלות ניאו-שריריות. OIR גורם neovascularization חזק לשחזור ברשתית שניתן לכמת.
Abstract
אחד המודלים הנפוצים עבור רטינופתיות איסכמיות הוא מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR). כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים עבור אינדוקציה מודל OIR ואת הקריאות שלה הן עכברים וחולדות. neovascularization הרשתית הוא המושרה OIR על ידי חשיפת גורי מכרסמים או hyperoxia (עכברים) או לסירוגין רמות של hyperoxia והיפוקסיה (חולדות). הקריאות העיקריות של מודלים אלה הן בגודל של אזורים ניאו-וסקולריים (NV) ו- AVA (AVA) ברשתית. מודל זה preclinical in vivo יכול לשמש כדי להעריך את היעילות של תרופות אנטי אנגיוגניות פוטנציאליות או כדי לטפל בתפקיד של גנים ספציפיים אנגיוגנזה ברשתית באמצעות בעלי חיים מניפולציה גנטית. המודל יש כמה זן וריאציה ספציפית ספק אינדוקציה OIR אשר יש לקחת בחשבון בעת תכנון הניסויים.
Introduction
מודלים ניסיוניים אמינים ומשוחזרים נדרשים כדי לחקור את הפתולוגיה שמאחורי מחלות עיניים אנגיוגניות ולפתח טיפולים חדשניים למחלות הרסניות אלה. אנגיוגנזה פתולוגית היא סימן ההיכר לניוון מקולרי רטוב הקשור לגיל (AMD) ועבור מחלות רשתית איסכמיות רבות ביניהן רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית מתפשטת (PDR) וחסימה של ורידים ברשתית (RVO)1,2,3,4. רשתית אנושית ומכרסמים בצע דפוס דומה של התפתחות, כמו רשתית הן אנושי מכרסמים הם בין הרקמות האחרונות כי הם vascularized. לפני כלי הדם ברשתית התפתחה לחלוטין, הרשתית מקבלת את אספקת התזונה שלה מן כלי הדם לשון, אשר, בתורו, רגרסיה כאשר כלי הדם ברשתית מתחיל לפתח1,2. אצל בני אדם, התפתחות כלי הדם ברשתית הושלמה לפני הלידה, ואילו מכרסמים הצמיחה של כלי הדם ברשתית מתרחשת לאחר הלידה. מאז התפתחות כלי הדם ברשתית מתרחשת לאחר הלידה מכרסמים, הוא מספק מערכת מודל אידיאלי ללמוד את אנגיוגנזה2,3. מכרסמים שזה עתה נולד יש רשתית כלי הדם המתפתחת בהדרגה עד פיתוח רשתית כלי הדם המלא מושגת עד סוף השבוע השלישי לאחר הלידה4. כלי הדם הגדלים של עכבר יילודים הם פלסטיק, והם עוברים רגרסיה במהלך גירוי hyperoxia5.
ROP היא הגורם המוביל לעיוורון בילדות במדינות המערב, שכן היא משפיעה על כמעט 70% מהפגים עם משקל לידה מתחת לגיל 1,250גרם 6,7. ROP מתרחשת אצל פגים שנולדים לפני כלי הרשתית להשלים את הצמיחה הרגילה שלהם. ROP מתקדמת בשני שלבים: בשלב I, לידה מוקדמת מעכבת את צמיחת כלי הדם ברשתית שבו לאחר שלב II, כלי הדם הלא גמורים של הרשתית המתפתחת גורמים להיפוקסיה, אשר גורמת לביטוי של גורמי גדילה אנגיוגניים הממריצים צמיחה חדשה ולא תקינה של כליהדם 8. מודל OIR היה מודל נפוץ לחקור את הפתופיזיולוגיה של ROP רטינופתיות איסכמיות אחרות, כמו גם כדי לבדוק מועמדים לתרופה הרומן2,3,9. זה נחשב באופן נרחב כמודל לשחזור לביצוע מחקרים הוכחת הרעיון עבור תרופות אנטי אנגיוגניות פוטנציאליות למחלות עיניים, כמו גם שאינם עינית. שני דגמי מכרסמים כלומר, עכבר וחולדה OIR שונים במודל שלהם אינדוקציה ומחלות פנוטיפ. מודל החולדה מחקה פנוטיפ ROP בצורה מדויקת יותר, אך מודל העכבר מספק מודל חזק יותר, מהיר יותר וניתן לשחזור עבור neovascularization הרשתית (NV). במודל העכבר, NV מפתחת לרשתית המרכזית. קריאה פתולוגית זו חשובה במחקרי יעילות פרמקולוגית עבור רטינופתיות איסכמיות רבות, כגון PDR, קרוואנים ו- AMD אקסוידטיבי, כמו גם למחלות אנגיוגניות שאינן עיניות כגון סרטן. יתר על כן, הזמינות של עכברים שעברו מניפולציה גנטית (מהונדסת ונוקאאוט) הופכת את דגם OIR של העכבר לאפשרות פופולרית יותר. עם זאת, לא עכבר ולא עכברוש מודל OIR יוצר פיברוזיס ברשתית, אשר אופייני במחלות אנושיות.
ההבנה כי רמות חמצן גבוהות תורמות להתפתחות ROP בשנות החמישים10,11 הוביל לפיתוח מודלים של בעלי חיים. המחקרים הראשונים על השפעת החמצן על כלי הדם ברשתית נעשו בשנת 195012,13,14 ועד שנות התשעים היו עידונים רבים למודל OIR. המחקר של סמית ואח ‘בשנת 1994 קבע תקן עבור מודל OIR העכבר הנוכחי המפריד בין עצם הלשון לרטינופתיה15. אימוץ רחב של השיטה לכמת vaso-השמדת NV פתולוגי על ידי קונור ואח ‘(2009) עוד יותר הגדיל את הפופולריות שלה16. במודל זה, עכברים ממוקמים ב 75% חמצן (O2) במשך 5 ימים ב P7, ואחריו 5 ימים בתנאים נורמוקסיים. Hyperoxia מ P7 כדי P12 גורם כלי הדם ברשתית לסגת ברשתית המרכזית. עם החזרה לתנאים הנורמוקסיים, הרשתית הופכת להיפוקסית (איור 1A). בשל הגירויים ההיפוקסיים של הרשתית המרכזית, חלק מכלי הדם ברשתית צומחים לכיוון הזגוגית, ויוצרים NV preretinal, הנקרא tufts preretinal2,3. ציצים אלה אינם בוגרים, ו hyperpermeable. כמות פסגות NV ב P17, לאחר מכן הוא נסוג. הרשתית היא revascularized מלא NV הוא נסוג לחלוטין על ידי P23 – P25 (איור 2A)2,3.
מודל OIR עכברוש (באמצעות רמות משתנות של O2) תואר לראשונה בשנות התשעים מראה כי משתנה O2 רמות ב 80% ו 40% לגרום NV בולט יותר מאשר תחת 80% O2 חשיפה מתמדת17. מאוחר יותר התגלה כי מודל היפוקסיה לסירוגין, שבו O 2 הוא רכב עלאופניים מ hyperoxia (50%) כדי היפוקסיה (10-12%), גורם אפילו יותר NV מאשר 80/40% O2 מודל18. במודל 50/10%, גורי חולדות חשופים ל -50% במשך 24 שעות, ואחריו 24 שעות ב -10% O2. מחזורים אלה נמשכים עד P14, כאשר גורי החולדות מוחזרים לתנאים נורמוקסיים (איור 1B). כמו בחולי ROP אנושיים, במודל החולדה מתפתחים אזורי החוליות לפריפריה של הרשתית בגלל מקלעת כלי דם רשתית לא בוגרת (איור 3).
בשני הדגמים, הפרמטרים העיקריים שבדרך כלל מכמתים הם בגודל של AVA ו- NV. פרמטרים אלה מנותחים בדרך כלל מן תושבות שטוחות ברשתית שבו תאי האנדותל מסומנים4,16. בעבר כמות NV preretinal הוערך חתכים ברשתית על ידי ספירת כלי דם או גרעיני תא כלי הדם המשתרעים זגוגית מעל הממברנה המגבילה הפנימית. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שלא ניתן לכמת את ה- AVAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
חומרת פנוטיפ המחלה תלויה הן בזן ואפילו בספק בדגמי OIR של עכברים וחולדות23. הדבר מצביע על כך שקיימת שונות גנוטיפית רחבה בהתפתחות הפתולוגית. באופן כללי, מכרסמים פיגמנטיים מפתחים פנוטיפ חמור יותר מאשר אלה לבקן. לדוגמה, כלי הדם ברשתית של לבקן BALB / c revascularizes במהירות לאחר hyperoxia ואינו מפ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למריאן קרלסברג, אן מארי הפנימי, פיבי פרטנן ואן קנקונן על תמיכה טכנית מצוינת. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה של פינלנד, Päivikki ו Sakari סולברג קרן, טמפרה שחפת קרן, קרן רפואית פינית, קרן המחקר המחוזית בית החולים Pirkanmaa וקרן המחקר של בית החולים אוניברסיטת טמפרה.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
References
- Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
- Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
- Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
- Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
- Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
- Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
- Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
- Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
- Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
- Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
- Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
- Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
- Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
- Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
- Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
- Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
- Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
- Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
- Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
- Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
- Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
- Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
- Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
- Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
- Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
- Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
- Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
- Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
- Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
- Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).
