Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

Summary

A retinopatia induzida pelo oxigênio (OIR) pode ser usada para modelar doenças isquêmicas da retina, como a retinopatia da prematuridade e a retinopatia diabética proliferativa e servir de modelo para estudos de prova de conceito na avaliação de drogas antiangiogênicas para doenças neovasculares. O OIR induz a neovascularização robusta e reprodutível na retina que pode ser quantificada.

Abstract

Um dos modelos comumente usados para retinopatias isquêmicas é o modelo de retinopatia induzida pelo oxigênio (OIR). Aqui descrevemos protocolos detalhados para a indução do modelo OIR e suas leituras em camundongos e ratos. A neovascularização da retina é induzida em OIR expondo filhotes de roedores à hiperoxia (camundongos) ou a níveis alternados de hiperoxia e hipóxia (ratos). As leituras primárias desses modelos são do tamanho das áreas neovasculares (NV) e avasculares (AVA) na retina. Este modelo in vivo pré-clínico pode ser usado para avaliar a eficácia de potenciais drogas anti-angiogênicas ou para abordar o papel de genes específicos na angiogênese da retina usando animais geneticamente manipulados. O modelo tem alguma variação específica de tensão e fornecedor na indução OIR que deve ser levada em consideração ao projetar os experimentos.

Introduction

Modelos experimentais confiáveis e reprodutíveis são necessários para estudar a patologia por trás de doenças oculares angiogênicas e desenvolver novas terapêuticas para essas doenças devastadoras. A angiogênese patológica é a marca registrada para a degeneração macular relacionada à idade úmida (DM) e para muitas doenças isquêmicas da retina entre elas a retinopatia da prematuridade (ROP), a retinopatia diabética proliferativa (PDR) e a oclusão da veia retinária (RVO)^1,2,3,4. As retinas humanas e roedores seguem um padrão de desenvolvimento semelhante, já que tanto a retina humana quanto a roedora estão entre os últimos tecidos vascularizados. Antes que a vasculatura da retina se desenvolva completamente, a retina recebe seu suprimento de nutrientes a partir da vasculatura hialoide, que, por sua vez, regrede quando a vasculatura da retina começa a se desenvolver^1,2. No desenvolvimento vascular humano, a retina é concluída antes do nascimento, enquanto nos roedores o crescimento da vasculatura da retina ocorre após o nascimento. Uma vez que o desenvolvimento vascular da retina ocorre postnatalmente em roedores, fornece um sistema modelo ideal para estudar a angiogênese^2,3. Os roedores recém-nascidos têm uma retina avascular que se desenvolve gradualmente até que o desenvolvimento completo da retina vascular seja alcançado até o final da terceira semana pós-natal⁴. Os vasos sanguíneos em crescimento do camundongo neonatal são plásticos, e sofrem regressão durante o estímulo da hiperoxia⁵.

O ROP é a principal causa de cegueira infantil nos países ocidentais, pois afeta quase 70% dos bebês prematuros com peso ao nascer abaixo de 1.250 g^6,7. O ROP ocorre em bebês prematuros que nascem antes que os vasos da retina completem seu crescimento normal. O ROP progride em duas fases: na Fase I, o nascimento prematuro atrasa o crescimento vascular da retina onde, após a fase II, a vascularização inacabada da retina em desenvolvimento causa hipóxia, o que induz a expressão de fatores de crescimento angiogênico que estimulam o crescimento de novos e anormais vasos sanguíneos⁸. O modelo OIR tem sido um modelo amplamente utilizado para estudar a fisiopatologia do ROP e outras retinopatias isquêmicas, bem como para testar novos candidatos a drogas^2,3,9. É amplamente considerado como um modelo reprodutível para a realização de estudos de prova de conceito para potenciais drogas antiangiogênicas para doenças oculares e não oculares. Os dois modelos de roedores, ou seja, o OIR de rato e rato diferem em seu modelo de indução e fenótipo da doença. O modelo de rato imita o fenótipo ROP com mais precisão, mas o modelo do mouse fornece um modelo mais robusto, rápido e reprodutível para neovascularização da retina (NV). No modelo do mouse, a NV se desenvolve para a retina central. Essa leitura patológica é importante em estudos de eficácia farmacológica para muitas retinopatias isquêmicas, como PDR, RV e DM exudativa, bem como para doenças angiogênicas não oculares, como o câncer. Além disso, a disponibilidade de camundongos geneticamente manipulados (transgênicos e nocautes) torna o modelo OIR do mouse uma opção mais popular. No entanto, nem o modelo de OIR de rato nem rato cria fibrose retinenta, que é típica em doenças humanas.

O entendimento de que altos níveis de oxigênio contribuem para o desenvolvimento da ROP na década de 1950^10,11 levou ao desenvolvimento de modelos animais. Os primeiros estudos sobre o efeito do oxigênio na vasculatura da retina foram feitos em 1950^12,13,14 e até a década de 1990 houve muitos refinamentos para o modelo OIR. A pesquisa de Smith et al. em 1994 estabeleceu um padrão para o modelo OIR do rato atual que separa a hialoidopatia da retinopatia¹⁵. Uma ampla adoção do método para quantificar a vaso-obliteração e o NV patológico por Connor et al. (2009) aumentou ainda mais sua popularidade¹⁶. Neste modelo, os camundongos são colocados a 75% de oxigênio (O₂) por 5 dias em P7, seguidos por 5 dias em condições normóxidas. A hiperoxia de P7 a P12 faz com que a vasculatura da retina regreda na retina central. Ao retornar às condições normóxicas, a retina avascular torna-se hipóxica (Figura 1A). Devido aos estímulos hipóxicos da retina central avascular, alguns dos vasos sanguíneos da retina brotam em direção ao vítreo, formando nv pré-retinal, chamado tufos pré-semanais^2,3. Estes tufos são imaturos e hiperpermeáveis. A quantidade de NV atinge picos em P17, após o qual ele regrede. A retina é totalmente revascularizada e a NV é totalmente regredida por P23 – P25 (Figura 2A)^2,3.

O modelo OIR de rato (utilizando níveis variados de O₂) foi descrito pela primeira vez na década de 1990 mostrando que níveis variados de O₂ a 80% e 40% causam mais NV pronunciado do que abaixo de 80% O₂ exposição constante¹⁷. Mais tarde, descobriu-se que o modelo de hipóxia intermitente, onde O₂ é ciclou da hiperoxia (50%) à hipóxia (10-12%), causa ainda mais NV do que o modelo 80/40% O₂ ¹⁸. No modelo 50/10%, os filhotes de rato são expostos a 50% durante 24 horas, seguidos por 24 horas em 10% O₂. Esses ciclos são continuados até P14, quando os filhotes de rato são devolvidos às condições normóxicas(Figura 1B). Assim como em pacientes humanos de ROP, no modelo de ratos as áreas avasculares desenvolvem-se para a periferia da retina por causa do plexo vascular imaturo da retina(Figura 3).

Em ambos os modelos, os principais parâmetros que geralmente são quantificados são o tamanho de AVA e NV. Esses parâmetros são tipicamente analisados a partir de montagens planas de retina onde as células endoteliais são rotuladas^4,16. Anteriormente, a quantidade de NV pré-retinal foi avaliada a partir de seções transversais da retina, contando vasos sanguíneos ou núcleos de células vasculares que se estendem até vítreos acima da membrana limitante interna. A maior limitação dessa abordagem é que não é possível quantificar os AVAs.

Protocol

O protocolo aqui descrito foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética Animal da Finlândia (número de protocolo ESAVI/9520/2020 e ESAVI/6421/04.10.07/2017). 1. Indução experimental de animais e modelo OIR do rato NOTA: Use animais com acasalamento de tempo, por exemplo, camundongos C57BL/6J comumente usados, para fazer filhotes nascerem no mesmo dia. Utilize barragens de fomento, por exemplo, 129 cepas (129S1/SvImJ ou 129S3/SvIM) para amamentar os filhotes durante…

Representative Results

O principal desfecho do modelo é o fenótipo vascular: o tamanho das AVAs e a quantidade de NV. No modelo OIR do camundongo, a vaso-obliteração ocorre na retina central (Figura 2A), enquanto no modelo de rato ele se desenvolve na periferia, ou seja, semelhante ao ROP22 humano (Figura 3A). Isso porque o plexo vascular superficial já se desenvolveu quando os camundongos são expostos à hiperoxia, enquanto no modelo de rato a retina é …

Discussion

A gravidade do fenótipo da doença depende tanto da cepa quanto mesmo do fornecedor nos modelos OIR de camundongos e ratos²³. Isso sugere que há uma ampla variabilidade genotipa no desenvolvimento da patologia. Em geral, roedores pigmentados desenvolvem fenótipo mais severo do que os albinos. Por exemplo, a vasculatura de retina do albino BALB/c revasculariza-se rapidamente após a hiperoxia e não desenvolve NV em todos os²⁴. Da mesma forma, em ratos, ratos da Noruega M…

Materials

33 gauge, Small Hub RN Needle	Hamilton Company	7803-05, 10mm, 25°, PS4	For intravitreal injection
Adobe Photoshop	Adobe Inc.		For image analysis
Air pump air100	Eheim GmbH & Co. KG.	143207	For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP	Univentor Ltd.	2360309	For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime	VWR International Ltd	22666.362	For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g	VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY	vnr 17 05 79	For inhalation anaesthesia
Brush			For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas			For sacrifice
Celeris D430 ERG system	Diagnosys LLC	121	For in vivo ERG
Cell culture dishes	Greiner Bio-One International GmbH	664 160	For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL	VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY	vnr 08 78 96	For anaesthesia
Cover slips	Thermo Fisher Scientific	15165452	For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier	Coy Laboratory Products		Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor	BioSphenix, Ltd.	E207, 1801901	For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)	Bioptigen, Inc.	BPN000668	For in vivo imaging
Eye spears	Beaver-Visitec International, Inc.	0008685	For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source	Mikron	11140	For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt	Merck KGaA	F6377-100G	For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)	UNO Roestvaststaal BV	GEX 17015249	For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN	Hamilton Company	7633-01	For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA)	Heidelberg Engineering GmbH	Spec-KT-05488	For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	I21411	For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL	Intervet International B.V.	vnr 51 14 85	For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas			For disease model induction
Mice C57BL/6JRj	Janvier Labs		Also other strains possible
Microscope slides	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ	For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit)	Bausch & Lomb U.K Limited	vnr 24 11 304	For intravitreal injection
Nitrogen gas			For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.	vnr 55 01 11	For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.	vnr 55 03 43	For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.	vnr 55 03 50	For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.	vnr 04 12 36	For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber	BioSphenix, Ltd.	803	For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber	BioSphenix, Ltd.	538	For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD)	Charles River Laboratories		Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL	VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY	vnr 13 04 97	For anaesthesia reversal
Silica gel			For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml	Alcon	Tamro 2050250	For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml	Alcon	Tamro 2064871	For hydration of the eye
Transfer pipette	Thermo Fisher Scientific	1343-9108	For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven	VWR	VL180S 170301	For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope	VWR	481067	For intravitreal injection or tissue collection