Кислород-индуцированной ретинопатии Модель ишемической болезни сетчатки у грызунов
Summary
Кислород-индуцированной ретинопатии (OIR) может быть использован для моделирования ишемических заболеваний сетчатки, таких как ретинопатия недоношенных и пролиферативной диабетической ретинопатии и служить в качестве модели для доказательства концепции исследований в оценке антиангиогенных препаратов для неоваскулярных заболеваний. OIR вызывает надежную и воспроизводимую неоваскуляризацию сетчатки, которую можно количественно оценить.
Abstract
Одной из часто используемых моделей ишемической ретинопатии является модель ретинопатии, вызванной кислородом (OIR). Здесь мы описываем подробные протоколы индукции модели OIR и ее считывания как у мышей, так и у крыс. Неоваскуляризация сетчатки индуцируется в OIR путем подвергая щенков грызунов либо гипероксия (мышей) или чередующихся уровней гипероксии и гипоксии (крысы). Основными считываниями этих моделей являются размеры неоваскулярных (NV) и аваскулярных (AVA) областей сетчатки. Эта доклиническая модель in vivo может быть использована для оценки эффективности потенциальных антиангиогенных препаратов или для решения роли конкретных генов в ангиогенезе сетчатки с помощью генетически манипулируемых животных. Модель имеет некоторые деформации и поставщика конкретных изменений в индукции OIR, которые должны быть приняты во внимание при разработке экспериментов.
Introduction
Надежные и воспроизводимые экспериментальные модели необходимы для изучения патологии ангиогенных заболеваний глаз и разработки новых терапевтических средств для этих разрушительных заболеваний. Патологический ангиогенез является отличительной чертой для мокрой возрастной макулярной дегенерации (AMD) и для многих ишемических заболеваний сетчатки, среди них ретинопатия недоношенности (ROP), пролиферативная диабетическая ретинопатия (PDR) и окклюзия сетчатки вен (RVO)1,2,3,4. Сетчатки человека и грызунов следуют аналогичной модели развития, так как и сетчатка человека, и сетчатка грызунов являются одними из последних тканей, которые сосудизируются. До того, как сосуды сетчатки полностью развились, сетчатка получает питательные вещества из гиалоидной сосудоуго роста, которая, в свою очередь, регрессирует, когда сосуды сетчаткиначинают развиваться 1,2. У человека развитие сосудов сетчатки завершается до рождения, тогда как у грызунов рост сосудов сетчатки происходит после рождения. Так как развитие сосудов сетчатки происходит постнатально у грызунов, она обеспечивает идеальную модельную систему для изученияангиогенеза 2,3. Новорожденные грызуны имеют аваскулярную сетчатку, которая развивается постепенно до полного развития сосудистой сетчатки достигается к концу третьей послеродовой недели4. Растущие кровеносные сосуды неонатальной мыши являются пластиковыми, и они проходят регрессию во время гипероксиистимул 5.
ROP является основной причиной детской слепоты в западных странах, так как она затрагивает почти 70% недоношенных детей с весом при рождении до 1250 г6,7. ROP происходит у недоношенных детей, которые рождаются до того, как сосуды сетчатки завершают свой нормальный рост. ROP прогрессирует в два этапа: в фазе I, преждевременные роды задержки роста сетчатки сосудов, где после фазы II, незавершенная васкуляризация развивающейся сетчатки вызывает гипоксию, которая вызывает выражение ангиогенных факторов роста, которые стимулируют новый и ненормальный рост кровеносныхсосудов 8. Модель OIR была широко используемой моделью для изучения патофизиологии ROP и других ишемических ретинопатий, а также для тестирования новыхкандидатов наркотиков 2,3,9. Он широко рассматривается в качестве воспроизводимой модели для проведения доказательных исследований для потенциальных антиангиогенных препаратов для глазных, а также неглазных заболеваний. Две модели грызунов, т.е. мышь и крыса OIR отличаются по своей модели индукции и фенотипа болезни. Модель крысы имитирует фенотип ROP более точно, но модель мыши обеспечивает более надежную, быструю и воспроизводимую модель неоваскуляризации сетчатки (NV). В модели мыши, NV развивается к центральной сетчатке. Это патологическое считывание имеет важное значение в фармакологических исследованиях эффективности для многих ишемических ретинопатий, таких как PDR, RV и экссудативных AMD, а также для неглазных, ангиогенных заболеваний, таких как рак. Кроме того, наличие генетически манипулируемых (трансгенных и нокаут) мышей делает модель мыши OIR более популярным вариантом. Однако ни мышь, ни крысиная модель OIR не создают фиброз сетчатки, что характерно для заболеваний человека.
Понимание того, что высокие уровни кислорода способствуют развитию РОП в 1950-хгодах 10,11 привело к развитию животных моделей. Первые исследования о влиянии кислорода на сосуды сетчатки были проведены в 1950году 12,13,14 и до 1990-х годов было много уточнений в модели OIR. Исследование Смита и др. в 1994 году установить стандарт для текущей модели мыши OIR, которая отделяет hyaloidopathy от ретинопатии15. Широкое принятие метода количественно вазо-уничтожения и патологических NV Коннор и др. (2009) еще больше увеличила свою популярность16. В этой модели, мыши помещаются на 75% кислорода (O2) в течение 5 дней на P7, а затем 5 дней в нормоксических условиях. Гипероксия от P7 до P12 вызывает сетчатки сосудов регрессировать в центральной сетчатке. По возвращении к нормоксическим условиям, аваскулярная сетчатка становится гипоксической(рисунок 1A). Из-за гипоксических стимулов аваскулярной центральной сетчатки, некоторые из кровеносных сосудов сетчатки прорастают к стекловидной, образуя предретинальные NV, называемые предретинальными пучками2,3. Эти пучки незрелые, и гиперпроницаемы. Количество NV достигает пика на P17, после чего регрессирует. Сетчатка полностью реваскуляризирована и NV полностью регрессирует P23 – P25(рисунок 2A)2,3.
Крыса OIR модель (с использованием различных уровней O2) был впервые описан в 1990-х годов показывает, чторазличные уровни O 2 на 80% и 40% вызывают более выраженным NV, чем под 80% O2 постоянное воздействие 17. Позже было обнаружено, что прерывистая модель гипоксии, где O2 циклически от гипероксии (50%) гипоксии (10-12 %), вызывает даже больше NV, чем 80/40% O2 модель18. В модели 50/10%, крысы щенки подвергаются воздействию 50% в течение 24 часов, а затем 24 часов в 10% O2. Эти циклы продолжаются до P14, когда щенки крыс возвращаются в нормоксические условия(рисунок 1B). Как и у пациентов ROP человека, в модели крысы сосудистые области развиваются на периферии сетчатки из-за незрелого сосудистого сплетения сетчатки(рисунок 3).
В обеих моделях основными параметрами, которые обычно количественно, являются размеры AVA и NV. Эти параметры обычно анализируются с плоских крепления сетчатки, где эндотелиальные клеткипомечены 4,16. Ранее количество предретинальных NV оценивалось из поперечных сечений сетчатки путем подсчета кровеносных сосудов или ядер сосудистых клеток, простирающихся до стекловидного оболочки над внутренней ограничивающей мембраной. Основным ограничением такого подхода является то, что невозможно количественно оценить АВА.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тяжесть фенотипа заболевания зависит как от штамма, так и даже от поставщика как в моделях мыши, так и от крыс OIR23. Это говорит о том, что в развитии патологии существует широкая генотипическая изменчивость. В целом у пигментированных грызунов развивается более тяжелый фено?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Марианну Карлсберг, Анн Мари Хаапаниеми, Пёйви Партанен и Анну Канккунен за отличную техническую поддержку. Эта работа финансировалась Академией Финляндии, Фондом Пяйвикки и Сакари Солбергом, Фондом Тампере Туберкулеза, Финским медицинским фондом, Районным исследовательским фондом больницы Пирканмаа и Фондом исследований больницы Университета Тампере.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
References
- Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
- Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
- Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
- Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
- Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
- Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
- Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
- Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
- Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
- Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
- Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
- Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
- Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
- Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
- Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
- Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
- Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
- Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
- Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
- Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
- Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
- Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
- Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
- Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
- Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
- Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
- Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
- Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
- Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
- Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).
