Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores
Summary
La retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se puede utilizar para modelar enfermedades retinianas isquémicas como la retinopatía de la prematuridad y la retinopatía diabética proliferativa y para servir como modelo para estudios de prueba de concepto en la evaluación de fármacos antiangiogénicos para enfermedades neovasculares. OIR induce neovascularización robusta y reproducible en la retina que se puede cuantificar.
Abstract
Uno de los modelos comúnmente utilizados para las retinopatías isquémicas es el modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR). Aquí describimos protocolos detallados para la inducción del modelo OIR y sus lecturas tanto en ratones como en ratas. La neovascularización retiniana se induce en OIR al exponer cachorros de roedores ya sea a hiperoxia (ratones) o niveles alternos de hiperoxia e hipoxia (ratas). Las lecturas primarias de estos modelos son el tamaño de las áreas neovasculares (NV) y avasculares (AVA) en la retina. Este modelo in vivo preclínico se puede utilizar para evaluar la eficacia de posibles fármacos anti-angiogénicos o para abordar el papel de genes específicos en la angiogénesis retiniana mediante el uso de animales genéticamente manipulados. El modelo tiene alguna variación específica de la tensión y del proveedor en la inducción OIR que debe tenerse en cuenta al diseñar los experimentos.
Introduction
Se necesitan modelos experimentales fiables y reproducibles para estudiar la patología detrás de las enfermedades oculares angiogénicas y para desarrollar nuevas terapias a estas devastadoras enfermedades. La angiogénesis patológica es el sello distintivo de la degeneración macular relacionada con la edad húmeda (DMAE) y para muchas enfermedades retinianas isquémicas entre ellas la retinopatía de la prematuridad (ROP), la retinopatía diabética proliferativa (PDR) y la oclusión venosa retiniana (RVO)1,2,3,4. Las retinas humanas y de roedores siguen un patrón de desarrollo similar, ya que tanto la retina humana como la de roedores se encuentran entre los últimos tejidos vascularizados. Antes de que la vasculatura retiniana se haya desarrollado por completo, la retina recibe su suministro de nutrientes a partir de vasculatura hialoide, que, a su vez, retrocede cuando la vasculatura retiniana comienza a desarrollarse1,2. En el ser humano, el desarrollo vascular de la retina se completa antes del nacimiento, mientras que en los roedores el crecimiento de la vasculatura retiniana ocurre después del nacimiento. Dado que el desarrollo vascular retiniano se produce postnatalmente en roedores, proporciona un sistema modelo ideal para estudiar la angiogénesis2,3. Los roedores recién nacidos tienen una retina avascular que se desarrolla gradualmente hasta que se logra un desarrollo completo de la retina vascular al final de la tercera semana postnatal4. Los vasos sanguíneos en crecimiento del ratón neonatal son plásticos, y se someten a regresión durante el estímulo de la hiperoxia5.
Rop es la principal causa de ceguera infantil en los países occidentales, ya que afecta a casi el 70% de los bebés prematuros con peso al nacer por debajo de 1.250 g6,7. El ROP ocurre en bebés prematuros que nacen antes de que los vasos de la retina completen su crecimiento normal. Rop progresa en dos fases: en la Fase I, el parto prematuro retrasa el crecimiento vascular retiniano donde después de la fase II, la vascularización inacabada de la retina en desarrollo causa hipoxia, lo que induce la expresión de factores de crecimiento angiogénicos que estimulan el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos y anormales8. El modelo OIR ha sido un modelo ampliamente utilizado para estudiar la fisiopatología del ROP y otras retinopatías isquémicas, así como para probar nuevos candidatos a fármacos2,3,9. Es ampliamente considerado como un modelo reproducible para llevar a cabo estudios de prueba de concepto para posibles fármacos antiangiogénicos para enfermedades oculares y no oculares. Los dos modelos de roedores, es decir, el ratón y la rata OIR difieren en su inducción modelo y fenotipo de enfermedad. El modelo de rata imita el fenotipo ROP con mayor precisión, pero el modelo del ratón proporciona un modelo más robusto, rápido y reproducible para la neovascularización retiniana (NV). En el modelo del ratón, el NV se desarrolla en la retina central. Esta lectura patológica es importante en estudios farmacológicos de eficacia para muchas retinopatías isquémicas, como PDR, RV y AMD exudativa, así como para enfermedades angiogénicas no oculares como el cáncer. Además, la disponibilidad de ratones genéticamente manipulados (transgénicos y knockouts) hace que el modelo OIR del ratón sea una opción más popular. Sin embargo, ni el modelo OIR de ratón ni rata crea fibrosis retiniana, que es típica en las enfermedades humanas.
La comprensión de que los altos niveles de oxígeno contribuyen al desarrollo de ROP en 1950s10,11 condujo al desarrollo de modelos animales. Los primeros estudios sobre el efecto del oxígeno en la vasculatura retiniana se realizaron en 195012,13,14 y hasta la década de 1990 hubo muchos refinamientos al modelo OIR. La investigación de Smith et al. en 1994 estableció un estándar para el actual modelo OIR del ratón que separa la hialoidopatía de la retinopatía15. Una amplia adopción del método para cuantificar el vaso-obliteration y el NV patológico por Connor et al. (2009) aumentó aún más su popularidad16. En este modelo, los ratones se colocan al 75% de oxígeno (O2)durante 5 días en P7, seguidos de 5 días en condiciones normóxicas. La hiperoxia de P7 a P12 hace que la vasculatura retiniana retroceda en la retina central. Al volver a las condiciones normóxicas, la retina avascular se vuelve hipoxica(Figura 1A). Debido a los estímulos hipoxicos de la retina central avascular, algunos de los vasos sanguíneos de la retina brotan hacia lo vítreo, formando NV preretinal, llamados mechones preretinales2,3. Estos mechones son inmaduros e hiperpermeables. La cantidad de NV alcanza su punto máximo en P17, después de lo cual retrocede. La retina está completamente revascularizada y NV es completamente retrocedida por P23 – P25 (Figura 2A)2,3.
El modelo OIR de rata (utilizando diferentes niveles de O2)se describió por primera vez en la década de 1990 mostrando que los niveles variables de O2 al 80% y 40% causan NV más pronunciado que por debajo del 80% O2 exposición constante17. Más tarde se descubrió que el modelo de hipoxia intermitente, donde O2 es ciclo de hiperoxia (50%) a la hipoxia (10-12 %), causa aún más NV que el 80/40% O2 modelo18. En el modelo 50/10%, los cachorros de rata están expuestos al 50% durante 24 horas, seguidos de 24 horas en 10% O2. Estos ciclos se continúan hasta P14, cuando los cachorros de rata son devueltos a condiciones normóxicas (Figura 1B). Al igual que en los pacientes con ROP humano, en el modelo de rata las áreas avasculares se desarrollan a la periferia de la retina debido al plexo vascular retiniano inmaduro(Figura 3).
En ambos modelos, los principales parámetros que normalmente se cuantifican son el tamaño de AVA y NV. Estos parámetros se analizan normalmente desde soportes planos retinianos donde las células endoteliales están etiquetadas como4,16. Anteriormente, la cantidad de NV preretinal se evaluaba a partir de secciones transversales retinianas contando núcleos de vasos sanguíneos o células vasculares que se extendían a vítreos por encima de la membrana limitante interna. La principal limitación de este enfoque es que no es posible cuantificar los AAV.
Protocol
Representative Results
Discussion
La gravedad del fenotipo de la enfermedad depende tanto de la cepa como del proveedor en los modelos OIR de ratón y rata23. Esto sugiere que hay una amplia variabilidad genotípica en el desarrollo de la patología. En general, los roedores pigmentados desarrollan un fenotipo más grave que los albino. Por ejemplo, la vasculatura retiniana de albino BALB/c revasculariza rápidamente después de la hiperoxia y no desarrolla NV en absoluto24. Del mismo modo, en ratas, las ra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen y Anne Kankkunen por su excelente apoyo técnico. Este trabajo fue financiado por la Academia de Finlandia, la Fundación Päivikki y Sakari Sohlberg, la Fundación Tampere Tuberculosis, la Fundación Médica Finlandesa, la Fundación de Investigación del Distrito Hospitalario pirkanmaa y el Fondo de Investigación hospitalaria de la Universidad de Tampere.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
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