Um ensaio ex vivo para estudar candida albicans Hórgênese Háfal no Trato Gastrointestinal

Summary

O ensaio ex vivo descrito neste estudo utilizando extratos de homogeneização intestinal e coloração de imunofluorescência representa um novo método para examinar a morfogênese húfa de Candida albicans no trato GI. Este método pode ser utilizado para investigar os sinais ambientais que regulam a transição morfogenética no intestino.

Abstract

A morfogênese húfala candida albicans no trato gastrointestinal (GI) é fortemente controlada por vários sinais ambientais, e desempenha um papel importante na disseminação e patogênese deste patógeno fúngico oportunista. No entanto, os métodos para visualizar a hifa fúngica no trato GI in vivo são desafiadores, o que limita a compreensão dos sinais ambientais no controle desse processo de morfogênese. O protocolo aqui descrito demonstra um novo método ex vivo para visualização da morfogênese hifal em extratos homogeneizados intestinais. Usando um ensaio ex vivo, este estudo demonstra que o conteúdo cecal de camundongos tratados com antibióticos, mas não de camundongos de controle não tratados, promovem a morfogênese háfagênese C. albicans no conteúdo intestinal. Além disso, adicionar de volta grupos específicos de metabólitos intestinais ao conteúdo cecal de camundongos tratados com antibióticos regula diferencialmente a morfogênese hifalina ex vivo. Em conjunto, este protocolo representa um novo método para identificar e investigar os sinais ambientais que controlam a morfogênese húfa cofálica no trato GI.

Introduction

Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista e polimórfico que normalmente é commensal, mas pode sofrer uma alteração morfológica em uma forma virulenta capaz de causar infecções fatais em indivíduos imunocomprometidos^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. C. albicans é uma das principais causas de infecções nosocomiais sistêmicas, com uma taxa de mortalidade de 40\u201260% mesmo com tratamento antifúngico^2,14,15. Embora os albicanos residam em diferentes nichos hospedeiros, incluindo o sistema reprodutivo feminino^16,17, a cavidade oral de indivíduos saudáveis¹⁸ e o trato gastrointestinal (GI)^19,20, a maioria das infecções sistêmicas originárias do trato GI e, além disso, a fonte de infecção sistêmica é frequentemente confirmada como o trato GI^{21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}. C. a patogenicidade dos albicanos no trato GI é influenciada por uma ampla gama de fatores; no entanto, uma característica importante necessária para a virulência é a transição de uma morfologia celular levedura para uma morfologia de células hífas virulenta^{35,36,37,38,39,40,41,42,43,44}. C. o apego e disseminação do trato de GI durante a infecção está altamente associado à sua capacidade de transição de uma levedura commensal para hifa virulenta, permitindo que os fungos causem doença invasiva^{44,45,46,47,48,49,50,51,52,53}.

Uma variedade de fatores no intestino, incluindo n-acetilglucosamina, regulam a formação hifáfal por C. albicans. Portanto, é crucial diminuir a lacuna de conhecimento sobre a morfogênese hifal deste patógeno fúngico no trato GI^54,55,56. Evidências recentes indicam que vários metabólitos intestinais controlam diferencialmente a morfogênese háfa de C. albicans in vitro^57,58,59,60. No entanto, as restrições técnicas apresentam problemas ao tentar estudar a formação de c. albicans hyphae em amostras in vivo, especialmente a coloração de leveduras e células de higia e análise quantitativa do desenvolvimento de higificos. Para entender a morfogênese hábica de C. albicans no trato GI, um método ex vivo foi desenvolvido utilizando extratos solúveis de conteúdo intestinal homogeneizado de camundongos para estudar o efeito de metabólitos na morfogênese húfa fúngica. Utilizando amostras intestinais de camundongos resistentes e suscetíveis à infecção por C. albicans GI, este método ajudará a identificar e estudar o efeito de metabólitos, antibióticos e xenobióticos na morfogênese húfa fúngica no trato GI.

Protocol

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Centro-Oeste (IACUC), conforme descrito antesde 57. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Centro-Oeste aprovou este estudo sob o Protocolo MWU IACUC #2894. As políticas de atenção animal da MWU seguem a Política de Atenção e Uso de Animais de Laboratório do Serviço Público de Saúde (PHS) e as políticas previstas na Lei de Bem-Estar A…

Representative Results

Esses resultados, juntamente com os achados anteriores do laboratório Thangamani60, indicam que quando os albicanos são cultivados ex vivo em extratos homogeneizados intestinais retirados do estômago, intestinos delgados e intestinos grandes de controle não tratado e camundongos tratados com antibióticos, C. albicans geralmente se desenvolve com uma morfologia de levedura(Figura 1B). No entanto, quando cultivados no extrato cecal de camundon…

Discussion

O método descrito aqui apresenta uma nova maneira de investigar o efeito de antibióticos, impactos dietéticos, xenobióticos e terapêuticos na morfogênese hífa de C. albicans no trato GI. Uma vez que a maioria das infecções sistêmicas se origina do trato GI^{21,22,23,24,25,26,27</s…}

Materials

1 – 10 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-454	Misc
100 – 1000 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-400	Misc
20 – 200 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-451	Misc
2-methylbutyric acid	Sigma	193070-25G	hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen (Fisher)	A11008	IF Staining secondary ab
Agar	Fisher	BP1423-500	YPD agar component
Automated Imaging Microscope	Keyence	BZX700
Candida Albicans Antibody	Invitrogen (Fisher)	PA1-27158	IF Staining primary ab
cefoperazone	Cayman	16113	antibiotic
deoxycholic acid	Sigma	30960	hyphal-inhibitory compound
D-Glucose	Fisher	D16-500	hyphal-promoting compound
forceps	Fisher	08-885
lactic acid	Alfa Aesar	AAAL13242-06	hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid	Sigma	L6250-10G	hyphal-inhibitory compound
palmitic acid	Sigma	P5585-10G	hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313	IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x	Alfa Aesar	J62692	PBS component
p-tolylacetic acid	SCBT	sc-257959	hyphal-inhibitory compound
sebacic acid	Sigma	283258-250G	hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors	Fisher	28301
sterile Milli-Q water	N/A	N/A	Misc
YPD Broth	BD Biosciences	242810	YPD agar component