माउस रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम की लाइट-पैदा हुई विद्युत प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए डायरेक्ट-युग्मित इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (डीसी-ईआरजी)
Summary
यहां, हम चूहों में रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) की प्रकाश-पैदा विद्युत प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, जिसे पहले 2000 के दशक में मारमोरस्टीन, पीची और सहयोगियों द्वारा वर्णित डीसी-ईआरजी के रूप में जाना जाता है।
Abstract
रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) रेटिना और कोरियोकैपिलरिस के बीच रणनीतिक रूप से स्थित कोशिकाओं का एक विशेष मोनोलेयर है जो फोटोरिसेप्टर्स के समग्र स्वास्थ्य और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है। आरपीई ध्रुवीकृत है, एपिक और बेसली स्थित रिसेप्टर्स या चैनलों का प्रदर्शन करता है, और पानी, आयनों, मेटाबोलाइट्स के वेक्टरल परिवहन करता है, और कई साइटोकिन्स का स्राव करता है।
आरपीई फ़ंक्शन के वीवो नॉनइनवेसिव मापों में प्रत्यक्ष-युग्मित ईआरजी (डीसी-ईआरजी) का उपयोग करके बनाया जा सकता है। डीसी-ईआरजी के पीछे की कार्यप्रणाली को मारमोरस्टीन, पीची और सहयोगियों द्वारा कस्टम-निर्मित उत्तेजना रिकॉर्डिंग प्रणाली का उपयोग करके बीड़ा उठाया गया था और बाद में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था। डीसी-ईआरजी तकनीक हैंक के बफर्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (एचबीबीएस) से भरी कांच की केशिकाओं का उपयोग करती है ताकि फोटोरिसेप्टर गतिविधि के कारण सबरेटिनल अंतरिक्ष में प्रकाश-पैदा एकाग्रता परिवर्तन से प्राप्त आरपीई की धीमी विद्युत प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए किया जा सके। लंबे समय तक प्रकाश उत्तेजना और डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग की लंबाई इसे बहाव और शोर के लिए असुरक्षित बनाती है जिसके परिणामस्वरूप उपयोग योग्य रिकॉर्डिंग की कम उपज होती है। यहां, हम रिकॉर्डिंग की स्थिरता में सुधार के लिए एक तेज, विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करते हैं, जबकि वैक्यूम दबाव का उपयोग करके शोर को कम करने/बुलबुले को खत्म करने के लिए है कि HBSS और इलेक्ट्रोड धारक के outgassing से परिणाम । इसके अतिरिक्त, बिजली लाइन कलाकृतियों एक वोल्टेज नियामक/बिजली कंडीशनर का उपयोग कर तनु हैं । हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईआरजी प्रणाली के लिए आवश्यक प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ-साथ डीसी-ईआरजी घटकों के विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट शामिल हैं: सी-वेव, तेज दोलन, प्रकाश शिखर, और प्रतिक्रिया से। रिकॉर्डिंग की बेहतर आसानी और तेजी से विश्लेषण कार्यप्रवाह के कारण, यह सरलीकृत प्रोटोकॉल आरपीई समारोह, रोग प्रगति और औषधीय हस्तक्षेप के आकलन में उम्र से संबंधित परिवर्तनों को मापने में विशेष रूप से उपयोगी है।
Introduction
रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) विशेष कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जो आंखों के पीछे के खंड को लाइन करता है और रेटिना होमोस्टेसिस1को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण कार्य करता है। आरपीई एक प्रक्रिया में अपने फोटॉन कैप्चरिंग दृश्य वर्णक को पुनर्जीवित करके फोटोरिसेप्टर्स का समर्थन करता है, जिसे दृश्य चक्र 2 कहाजाताहै, शेड आउटर सेगमेंट टिप्स3के दैनिक फैगोसाइटोसिस में भाग लेकर, और फोटोरिसेप्टर्स और कोरियोकैपिलरिस4,5के बीच पोषक तत्वों और मेटाबोलिक उत्पादों के परिवहन में। आरपीई फ़ंक्शन में असामान्यताएं कई मानव रेटिना रोगों को रेखांकित करती हैं, जैसे कि उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन6,लेबर की जन्मजात अमौरोसिस7,8 और बेस्ट विटेलीफॉर्म मैक्युलर डिस्ट्रॉफी9। चूंकि दाता नेत्र ऊतकों को अक्सर केवल अनुसंधान उद्देश्यों के लिए प्राप्त करना मुश्किल होता है, आनुवंशिक संशोधनों वाले पशु मॉडल रेटिना रोगों के विकास का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान कर सकते हैं10,11। इसके अतिरिक्त, CRISPR cas9 प्रौद्योगिकी का उद्भव और अनुप्रयोग अब पूर्व जीन लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकियों की सीमाओं को पार करते हुए एक सरल, एक कदम की प्रक्रिया में जीनोमिक परिचय (नॉक-इन) या विलोपन (नॉक-आउट) की अनुमति देता है12। नए माउस मॉडल13 की उपलब्धता में तेजी को आरपीई फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक अधिक कुशल रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।
आरपीई की हल्की-पैदा हुई विद्युत प्रतिक्रियाओं का मापन प्रत्यक्ष-युग्मित इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (डीसी-ईआरजी) तकनीक का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। जब पारंपरिक ईआरजी रिकॉर्डिंग के संयोजन में उपयोग किया जाता है जो फोटोरिसेप्टर (ए-वेव) और बाइपोलर (बी-वेव) सेल प्रतिक्रियाओं को मापते हैं14,डीसी-ईआरजी यह परिभाषित कर सकते हैं कि रेटिना अध: पतन15, 16,17के साथ आरपीई की प्रतिक्रिया गुण कैसे बदलते हैं या क्या आरपीई की शिथिलता फोटोरिसेप्टर हानि से पहले होती है। यह प्रोटोकॉल मार्मोरस्टीन, पीची और सहयोगियों के काम से अनुकूलित एक विधि का वर्णन करता है जिन्होंने पहले डीसी-ईआरजी तकनीक16, 18,19,20 विकसित की और प्रजनन क्षमता और उपयोग में आसानी में सुधार किया।
डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग लंबे अधिग्रहण समय (9 मिनट) के कारण प्रदर्शन करना मुश्किल है जिसके दौरान शोर की कोई रुकावट या परिचय डेटा की व्याख्या को जटिल बना सकता है। इस नई विधि का लाभ यह है कि बेसलाइन समय की एक छोटी राशि के भीतर स्थिर स्थिति तक पहुंचने की संभावना है कि जानवर संज्ञाहरण से समय से पहले जागजाएगा और केशिका इलेक्ट्रोड में बुलबुला गठन के लिए कम प्रवण है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
महत्वपूर्ण कदम
एक अच्छा डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग के लिए स्थिर इलेक्ट्रोड की आवश्यकता होती है जो बुलबुले से मुक्त होते हैं जो कलाकृतियों और अवांछित बहाव बनाते हैं क्योंकि वे आउटगैसिंग औ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एनईआई इंट्राम्यूरल फंड्स ने सपोर्ट किया था । लेखक ईमानदारी से डॉ शेल्डन मिलर को उनके वैज्ञानिक मार्गदर्शन, तकनीकी सलाह और आरपीई फिजियोलॉजी और रोग में विशेषज्ञता के लिए स्वीकार करते हैं। लेखकों ने मेगन कोपेरा और माउस कालोनियों के प्रबंधन के लिए एनिमल केयर स्टाफ और डॉ तरुण बंसल, रेमंड झोउ और युआन वांग को तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया ।
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
