Direkte skrevet Electroretinogram (DC-ERG) for opptak av lys-fremkalt elektriske svar av musen Retinal Pigment Epitel
Summary
Her presenterer vi en metode for registrering av lys fremkalte elektriske responser av retinal pigment epitel (RPE) hos mus ved hjelp av en teknikk kjent som DC-ERGs først beskrevet av Marmorstein, Peachey, og kolleger tidlig på 2000-tallet.
Abstract
Retinal pigment epitel (RPE) er et spesialisert monolayer av celler strategisk plassert mellom netthinnen og choriocapillaris som opprettholder den generelle helse og strukturelle integriteten til fotoreseptorene. RPE er polarisert, viser apically og basalt plassert reseptorer eller kanaler, og utfører vektoral transport av vann, ioner, metabolitter, og utskiller flere cytokiner.
In vivo ikke-invasive målinger av RPE-funksjonen kan gjøres ved hjelp av direkte forbindelser (DC-ERGs). Metodikken bak DC-ERG ble banebrytende av Marmorstein, Peachey og kolleger ved hjelp av et spesialbygd stimuleringsopptakssystem og senere demonstrert ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system. DC-ERG-teknikken bruker glasskapillærer fylt med Hanks bufrede saltløsning (HBSS) for å måle de langsommere elektriske reaksjonene til RPE fremkalt fra lyskalte konsentrasjonsendringer i subretinalrommet på grunn av fotoreseptoraktivitet. Den langvarige lysstimulansen og lengden på DC-ERG-opptaket gjør den sårbar for drift og støy som resulterer i et lavt utbytte av brukbare opptak. Her presenterer vi en rask og pålitelig metode for å forbedre stabiliteten til opptakene samtidig som vi reduserer støy ved å bruke vakuumtrykk for å redusere/eliminere bobler som følge av utgassing av HBSS og elektrodeholderen. I tillegg dempes strømledningsartefakter ved hjelp av en spenningsregulator/strømbetinging. Vi inkluderer de nødvendige lysstimuleringsprotokollene for et kommersielt tilgjengelig ERG-system, samt skript for analyse av DC-ERG-komponentene: c-bølge, rask svingning, lystopp og av respons. På grunn av den forbedrede enkle opptaks- og hurtiganalysearbeidsflyten er denne forenklede protokollen spesielt nyttig for måling av aldersrelaterte endringer i RPE-funksjon, sykdomsprogresjon og i vurderingen av farmakologisk intervensjon.
Introduction
Retinal pigment epitel (RPE) er en monolayer av spesialiserte celler som linje bakre segmentet av øyet og utøve kritiske funksjoner for å opprettholde retinal homeostase1. RPE støtter fotoreseptorer ved å regenerere deres fotonfangende visuelle pigment i en prosess som kalles den visuellesyklus 2, ved å delta i dagsfagocytose av skur ytre segmenttips3, og i transport av næringsstoffer og metabolske produkter mellom fotoreseptorer og choriocapillaris4,5. Abnormiteter i RPE-funksjonen ligger til grunn for mange humane retinale sykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon6,Lebers medfødte amaurosis7,8 og Best vitelliform makuladystrofi9. Som donor øye vev er ofte vanskelig å få utelukkende for forskningsformål, dyremodeller med genetiske modifikasjoner kan gi en alternativ måte å studere utviklingen av retinal sykdommer10,11. I tillegg tillater fremveksten og anvendelsen av CRISPR cas9-teknologi nå genomiske introduksjoner (knock-in) eller slettinger (knock-out) i en enkel, ett-trinns prosess som overgår begrensninger av tidligere genmålrettingsteknologier12. Bommen i tilgjengeligheten av nye musemodeller13 krever en mer effektiv opptaksprotokoll for å ikke-invasivt evaluere RPE-funksjonen.
Måling av RPEs lyskalkede elektriske responser kan oppnås ved hjelp av en direkte skrevet elektroretinogram (DC-ERG) teknikk. Når den brukes i kombinasjon med konvensjonelle ERG-opptak som måler fotoreseptoren (a-bølge) og bipolare (b-bølge)celleresponser 14, kan DC-ERG definere hvordan responsegenskapene til RPE endres med retinal degenerasjon15,16,17 ellerom RPE-dysfunksjon går forut for fotoreseptortap. Denne protokollen beskriver en metode tilpasset fra arbeidet til Marmorstein, Peachey, og kolleger som først utviklet DC-ERG teknikk16,18,19,20 og forbedrer reproduserbarhet og brukervennlighet.
DC-ERG-opptaket er vanskelig å utføre på grunn av den lange oppkjøpstiden (9 min) der eventuelle avbrudd eller innføring av støy kan komplisere tolkningen av dataene. Fordelen med denne nye metoden er at grunnlinjene når jevn tilstand innen kortere tid, noe som reduserer sannsynligheten for at dyret vil våkne for tidlig fra anestesi og er mindre utsatt for bobledannelse i kapillære elektroder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn
Et godt DC-ERG-opptak krever stabile elektroder som er fri for bobler som skaper artefakter og uønsket drift, da de er ekstremt følsomme for utgassing og temperaturendringer. Det er viktig at en stabil grunnlinje oppnås når elektrodene plasseres i HBSS-badeløsningen før de fortsetter med museopptaket. Små bobler har en tendens til å samle seg ved foten av kapillærelektroden eller rundt silikonpakningen og er vanskelig å se når elektrodeholderen er fer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NEI intramural midler. Forfatterne anerkjenner oppriktig Dr. Sheldon Miller for hans vitenskapelige veiledning, tekniske råd og ekspertise innen RPE fysiologi og sykdom. Forfatterne takker Megan Kopera og dyrepleiepersonalet for å administrere musekoloniene, og Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou og Yuan Wang for teknisk støtte.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
