Ici, nous présentons une méthode pour enregistrer les réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez la souris en utilisant une technique connue sous le nom de DC-ERGs décrite pour la première fois par Marmorstein, Peachey et ses collègues au début des années 2000.
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Article de méthode
Électrorétinogramme couplé direct (DC-ERG) pour l’enregistrement des réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est un monocouche spécialisé de cellules stratégiquement situées entre la rétine et les choriocapillaris qui maintiennent la santé globale et l’intégrité structurale des photorécepteurs. L’EPR est polarisée, présente des récepteurs ou des canaux situés de façon apique et basique, et effectue le transport vectoriel de l’eau, des ions, des métabolites et sécrète plusieurs cytokines.
Des mesures in vivo non invasives de la fonction RPE peuvent être effectuées à l’aide d’ERGs couplés directs (DC-ERGs). La méthodologie derrière le DC-ERG a été mise au point par Marmorstein, Peachey et ses collègues à l’aide d’un système d’enregistrement de stimulation sur mesure et a ensuite démontré l’utilisation d’un système disponible dans le commerce. La technique DC-ERG utilise des capillaires en verre remplis de la solution de sel tamponné (HBSS) de Hank pour mesurer les réponses électriques plus lentes de l’EPR obtenues par les changements de concentration évoqués par la lumière dans l’espace sous-réceptif en raison de l’activité des photorécepteurs. Le stimulus léger prolongé et la longueur de l’enregistrement DC-ERG le rendent vulnérable à la dérive et au bruit, ce qui entraîne un faible rendement d’enregistrements utilisables. Ici, nous présentons une méthode rapide et fiable pour améliorer la stabilité des enregistrements tout en réduisant le bruit en utilisant la pression sous vide pour réduire/éliminer les bulles qui résultent de l’outgassing du HBSS et du support d’électrode. En outre, les artefacts de la ligne électrique sont atténués à l’aide d’un régulateur de tension / conditionneur de puissance. Nous incluons les protocoles de stimulation lumineuse nécessaires pour un système ERG disponible dans le commerce ainsi que des scripts pour l’analyse des composants DC-ERG : c-wave, oscillation rapide, pic lumineux et réponse éteinte. En raison de la facilité améliorée des enregistrements et du flux de travail rapide d’analyse, ce protocole simplifié est particulièrement utile en mesurant des changements relatifs à l’âge dans la fonction de RPE, la progression de la maladie, et dans l’évaluation de l’intervention pharmacologique.
Introduction
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est un monocouche de cellules spécialisées qui tapissent le segment postérieur de l’œil et exercent des fonctions critiques pour maintenir l’homéostasierétinienne 1. Le RPE prend en charge les photorécepteurs en régénérant leur pigment visuel photon-capture dans un processus appelé le cycle visuel2, en participant à la phagocytose diurne des pointes du segment extérieurhangar 3, et dans le transport des nutriments et des produits métaboliques entre les photorécepteurs et les choriocapillaris4,5. Les ....
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Protocole
Ce protocole fait suite aux lignes directrices sur les soins aux animaux décrites dans le protocole d’étude des animaux approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut national de l’œil.
1. Importation de protocoles de stimulation lumineuse pour DC-ERG
REMARQUE : Suivez les instructions ci-dessous pour importer les protocoles de stimulation lumineuse du DC-ERG dans le logiciel du système ERG (Tableau des matériaux). Le protocole se compose d’un intervalle de pré-stimulus de 0,5 min, suivi d’un pas de lumière (10 cd/m2)pendant 7 min, et se terminant par un i....
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Résultats
La figure 2 est un ensemble de données d’échantillons provenant de souris miR-204 ko/ko cre/+ (KO conditionnelle) et sauvages (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ sont des souris avec un KO conditionnel de microARN 204 dans l’épithélium pigmentaire rétinien. Ces souris sont générées en croisant des souris miR-204 floxées (produites par NEIGEF)22 avec des souris VMD2-CRE23. MiR-204 est fortement exprimé dans l’EPR où il régule l’expression des protéines cr.......
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Discussion
Étapes critiques
Un bon enregistrement DC-ERG nécessite des électrodes stables qui sont exemptes de bulles qui créent des artefacts et des dérives indésirables car elles sont extrêmement sensibles au dégazage et aux changements de température. Il est essentiel qu’une ligne de base stable soit atteinte lorsque les électrodes sont placées dans la solution de bain HBSS avant d’aller de l’avant avec l’enregistrement de la souris. Les petites bulles ont tendance à s’accumuler à la .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des fonds intra-muros nei. Les auteurs reconnaissent sincèrement le Dr Sheldon Miller pour ses conseils scientifiques, ses conseils techniques et son expertise en physiologie et en maladie de l’EPR. Les auteurs remercient Megan Kopera et le personnel de soins aux animaux pour la gestion des colonies de souris, ainsi que le Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou et Yuan Wang pour leur soutien technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Électrode Ag/AgCl (bouche) | WPI Inc | EP1 | Électrode de référence buccale pour souris |
| Instrument | sutter | CTS | Utilisé pour couper le tube capillaire en verre à une taille appropriée |
| Bâton de nettoyage à pointe de coton | Puritan Medical Products | 867-WC Pas de colle | À utiliser comme entretoise pour améliorer l’ajustement de l’ensemble porte-électrode Système d’électrorétinogramme |
| (ERG) | Système Diagnosys LLC | E3 | Système d’électrophysiologie visuelle pour diagnostiquer les affections ophtalmiques dans la recherche sur la vision et les essais de médicaments |
| Bec Bunsen | Argos Technologies | BW20002460 | Or équivalent pour façonner le verre sous flamme |
| Tube capillaire en verre (1,5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | Pour le remplissage avec HBSS et le contact avec la cornée |
| Hank' s Solution saline tamponnée (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Disponible dans le commerce. Maintenir chez RT |
| Filtre en ligne | Whatman | 6722-5001 | Pour protéger la pompe à vide des aérosols |
| Câble silencieux pour porte-microélectrodes | WPI Inc | 5372 | Suggéré pour améliorer la longueur et le placement des câbles et des ensembles de porte-électrodes |
| Rotule magnétique | WPI Inc | 500871 | Pour positionner magnétiquement l’ensemble porte-électrode sur la scène |
| MatLab | Mathworks | MatLab : pour la modification du logiciel d’analyse | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox pour MatLab (uniquement requis pour la modification du logiciel d’analyse) | |
| Compilateur MatLab | Mathworks | Toolbox pour MatLab (requis uniquement pour la modification et la réédition du logiciel d’analyse) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Nécessaire pour faire fonctionner le logiciel d’analyse : https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Porte-microélectrodes (45 degrés) | WPI Inc | MEH345-15 | Pour maintenir les capillaires |
| Aiguille (25 ga) | Covidien | 8881250313 | Pour remplir les tubes capillaires avec HBSS |
| Aiguille (terre) | Électrode Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Électrode à aiguille sous-cutanée (terre) pour souris (13 mm de long, aiguille de 0,4 mm de diamètre, fil conducteur de 1,5 m) |
| Régulateur/conditionneur de puissance | Furman | P-1800 | Ou équivalent pour éliminer le décalage CC du bruit introduit par la seringue de ligne électrique |
| (12 mL) | Monoject | 1181200777 | Pour remplir les tubes capillaires avec HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | Pour l’assemblage du porte-électrode |
| Dessiccateur sous vide | Bel-Art | 420120000 | Fond et couvercle |
| Traitement pharmacologique | |||
| Gel lubrifiant pour les yeux | Alcon | 0078-0429-47 | Aide à lubrifier la surface de la cornée et à maintenir le contact électrique avec les électrodes capillaires |
| Chlorhydrate de phényléphrine 2,5 % | Akorn | 17478-201-15 | Gouttes ophtalmiques mydriatiques à courte durée d’action (pour la dilatation des pupilles) |
| Chlorhydrate de proparacaïne 0,5 % | Akorn | 17478-263-12 | Anesthésique local pour l’instillation ophtalmique |
| Tropicamide 0,5 % | Akorn | 17478-101-12 | Gouttes oculaires mydriatiques à courte durée d’action (pour la dilatation des pupilles) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgésique et relaxant musculaire |
| Zetamine (Kétamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthésique pour injections intramusculaires |
Références
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in....
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Réimpressions et autorisations
