Direkt-kopplade elektroretinogram (DC-ERG) för inspelning av ljus-evoked elektriska svar av musen Retinal Pigment Epitel
Summary
Här presenterar vi en metod för att registrera ljus-evoked elektriska svar av retinal pigment epitel (RPE) i möss med hjälp av en teknik som kallas DC-ERGs först beskrivs av Marmorstein, Peachey, och kollegor i början av 2000-talet.
Abstract
Näthinnans pigmentepitelet (RPE) är en specialiserad monolayer av celler som är strategiskt placerade mellan näthinnan och choriocapillaris som upprätthåller fotoreceptorernas allmänna hälsa och strukturella integritet. Den RPE är polariserad, uppvisar apiskt och basalt belägna receptorer eller kanaler, och utför vektorala transporter av vatten, joner, metaboliter, och utsöndrar flera cytokiner.
In vivo noninvasive mätningar av RPE-funktionen kan göras med hjälp av direkt-kopplade ERGs (DC-ERGs). Metoden bakom DC-ERG var pionjärer marmorstein, Peachey, och kollegor med hjälp av en specialbyggd stimulering inspelningssystem och senare visat med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt system. DC-ERG-tekniken använder glaskapillärer fyllda med Hanks buffrade saltlösning (HBSS) för att mäta de långsammare elektriska svaren från RPE som framkallas från ljusuppmanade koncentrationsförändringar i det subretinala utrymmet på grund av fotoreceptoraktivitet. Den långvariga ljusstimulansen och längden på DC-ERG-inspelningen gör den sårbar för drift och buller vilket resulterar i en låg avkastning på användbara inspelningar. Här presenterar vi en snabb, tillförlitlig metod för att förbättra stabiliteten i inspelningarna samtidigt som du minskar bullret genom att använda vakuumtryck för att minska/eliminera bubblor som resulterar från utgasning av HBSS och elektrodhållaren. Dessutom är kraftledningsartefakter försvagade med hjälp av en spänningsregulator / power-balsam. Vi inkluderar nödvändiga protokoll för ljusstimulering för ett kommersiellt tillgängligt ERG-system samt skript för analys av DC-ERG-komponenterna: c-wave, snabb svängning, ljustopp och off-respons. På grund av den förbättrade lätt för inspelningar och snabb analys arbetsflöde, detta förenklade protokollet är särskilt användbart för att mäta åldersrelaterade förändringar i RPE funktion, sjukdomsprogression, och i bedömningen av farmakologiska intervention.
Introduction
Den näthinnans pigment epitel (RPE) är en monolayer av specialiserade celler som linje den bakre delen av ögat och utöva kritiska funktioner för att upprätthålla näthinnans homeostas1. Den RPE stöder fotoreceptorer genom att regenerera deras foton-fånga visuella pigment i en process som kallas den visuellacykeln 2, genom att delta i dagaktiva fagocytos av skjul yttre segment tips3, och i transporten av näringsämnen och metaboliska produkter mellan fotoreceptorer och choriocapillaris4,5. Avvikelser i RPE funktion ligger bakom ett flertal mänskliga näthinnesjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration6, Lebers medfödda amaurosis7,8 och Bästa vitelliform makuladystrofi9. Eftersom donatorögonvävnader ofta är svåra att få enbart för forskningsändamål kan djurmodeller med genetiska modifieringar ge ett alternativt sätt att studera utvecklingen av näthinnesjukdomar10,11. Dessutom tillåter framväxten och tillämpningen av CRISPR cas9-tekniken nu genomiska introduktioner (knock-in) eller strykningar (knock-out) i en enkel enstegsprocess som överträffar begränsningarna av tidigare geninriktningsteknik12. Bommen i tillgången på nya musmodeller13 nödvändiggör ett effektivare inspelningsprotokoll för att icke-invasivt utvärdera RPE-funktionen.
Mätning av de ljusuppmanade elektriska svaren från RPE kan uppnås med hjälp av en direktkoppling elektroretinogram (DC-ERG) teknik. När de används i kombination med konventionella ERG-inspelningar som mäter fotoreceptorn (a-wave) och bipolär (b-wave) cellsvar14, kan DC-ERG definiera hur RPE-nas responsegenskaper förändras med retinal degeneration15,16,17 eller om RPE-dysfunktion föregår fotoreceptorförlust. Detta protokoll beskriver en metod som anpassas från arbetet av Marmorstein, Peachey, och kollegor som först framkallade DC-ERG-tekniken16,18,19,20 och förbättrar på reproducerbarheten och lindrar av bruk.
DC-ERG-inspelningen är svår att utföra på grund av den långa förvärvstiden (9 min) under vilken eventuella avbrott eller införande av buller kan försvåra tolkningen av uppgifterna. Fördelen med denna nya metod är att baslinjerna når steady state inom en kortare tid som minskar sannolikheten för att djuret kommer att vakna i förtid från anestesi och är mindre benägna att bubbla bildas i kapillärelektroderna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg
En bra DC-ERG-inspelning kräver stabila elektroder som är fria från bubblor som skapar artefakter och oönskad drift då de är extremt känsliga för utgasning och temperaturförändringar. Det är väsentligt att en stabil baslinje uppnås när elektroderna placeras i HBSS-badlösningen innan man går vidare med musinspelningen. Små bubblor tenderar att samla vid basen av kapillärelektroden eller runt silikonpackningen och är svåra att se när elektrodh?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NEI intramural fonder. Författarna erkänner uppriktigt Dr Sheldon Miller för hans vetenskapliga vägledning, teknisk rådgivning och expertis inom RPE fysiologi och sjukdom. Författarna tackar Megan Kopera och djurvårdspersonal för att hantera musen kolonier, och Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, och Yuan Wang för tekniskt stöd.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber’s congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the “light-peak substance”. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
