Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón
Summary
Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.
Abstract
El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa especializada de células ubicadas estratégicamente entre la retina y los coriocapillaris que mantienen la salud general y la integridad estructural de los fotorreceptores. El RPE está polarizado, exhibiendo receptores o canales ubicados de manera apóptica y basal, y realiza el transporte vectorial de agua, iones, metabolitos y secreta varias citoquinas.
Las mediciones in vivo no invasivas de la función RPE se pueden realizar utilizando ERG de acoplamiento directo (DC-ERG). La metodología detrás del DC-ERG fue pionera por Marmorstein, Peachey y sus colegas utilizando un sistema de grabación de estimulación personalizado y más tarde demostrado utilizando un sistema disponible comercialmente. La técnica DC-ERG utiliza capilares de vidrio llenos de solución de sal tamponada de Hank (HBSS) para medir las respuestas eléctricas más lentas del RPE provocadas por cambios de concentración evocados por la luz en el espacio subretinal debido a la actividad del fotorreceptor. El prolongado estímulo de luz y la duración de la grabación DC-ERG lo hacen vulnerable a la deriva y al ruido, lo que resulta en un bajo rendimiento de grabaciones utilizables. Aquí, presentamos un método rápido y confiable para mejorar la estabilidad de las grabaciones al tiempo que reduce el ruido mediante el uso de la presión de vacío para reducir / eliminar las burbujas que resultan de la desgasificación del HBSS y el soporte del electrodo. Además, los artefactos de la línea de alimentación se atenúan mediante un regulador de voltaje/acondicionador de potencia. Incluimos los protocolos de estimulación de la luz necesarios para un sistema ERG disponible comercialmente, así como scripts para el análisis de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. Debido a la mayor facilidad de grabaciones y el flujo de trabajo de análisis rápido, este protocolo simplificado es particularmente útil para medir los cambios relacionados con la edad en la función de RPE, la progresión de la enfermedad y en la evaluación de la intervención farmacológica.
Introduction
El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa de células especializadas que recuben el segmento posterior del ojo y ejercen funciones críticas para mantener la homeostasis retinal1. El RPE soporta fotorreceptores mediante la regeneración de su pigmento visual fotones-captura en un proceso llamado ciclo visual2,participando en la fagocitosis diurna del segmento exterior del cobertizo puntas3,y en el transporte de nutrientes y productos metabólicos entre fotorreceptores y los coriocapillaris4,5. Las anomalías en la función de la EPH subyacen a numerosas enfermedades de la retina humana, como la degeneración macular relacionada con la edad6,la amaurosis congénita de Leber7,8 y la mejor distrofia macular vitelliforma9. Como los tejidos oculares de los donantes a menudo son difíciles de obtener únicamente con fines de investigación, los modelos animales con modificaciones genéticas pueden proporcionar una forma alternativa de estudiar el desarrollo de enfermedades de la retina10,11. Además, la aparición y aplicación de la tecnología CRISPR cas9 permite ahora introducciones genómicas (knock-in) o eliminaciones (knock-out) en un proceso simple de un solo paso superando las limitaciones de las tecnologías de apuntamiento genético anterior12. La auge en la disponibilidad de los nuevos modelos deratón 13 requiere un protocolo de grabación más eficiente para evaluar de forma no invasiva la función RPE.
La medición de las respuestas eléctricas evocadas por la luz del RPE se puede lograr mediante una técnica de electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG). Cuando se utiliza en combinación con grabaciones ERG convencionales que miden las respuestas celulares del fotorreceptor (onda a) y bipolar (onda b)14, el DC-ERG puede definir cómo cambian las propiedades de respuesta del RPE con la degeneración de la retina15,16,17 o si la disfunción del RPE precede a la pérdida del fotorreceptor. Este protocolo describe un método adaptado del trabajo de Marmorstein, Peachey y sus colegas que desarrollaron por primera vez la técnica DC-ERG16,18,19,20 y mejora la reproducibilidad y facilidad de uso.
La grabación DC-ERG es difícil de realizar debido al largo tiempo de adquisición (9 min) durante el cual cualquier interrupción o introducción de ruido puede complicar la interpretación de los datos. La ventaja de este nuevo método es que las líneas de base alcanzan un estado estable en un período de tiempo más corto reduciendo la probabilidad de que el animal despierte prematuramente de la anestesia y sea menos propenso a la formación de burbujas en los electrodos capilares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos
Una buena grabación DC-ERG requiere electrodos estables que están libres de burbujas que crean artefactos y deriva no deseada, ya que son extremadamente sensibles a la desgasificación y los cambios de temperatura. Es esencial que se alcance una línea de base estable cuando los electrodos se colocan en la solución de baño HBSS antes de continuar con la grabación del ratón. Las pequeñas burbujas tienden a acumularse en la base del electrodo capilar o alr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los fondos intramuros de NEI. Los autores reconocen sinceramente al Dr. Sheldon Miller por su orientación científica, asesoramiento técnico y experiencia en fisiología y enfermedades de RPE. Los autores agradecen a Megan Kopera y al personal de cuidado de animales por administrar las colonias de ratones, y al Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou y Yuan Wang por el apoyo técnico.
Materials
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| Matlab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| needle (ground) electrode | Rhythmlink | 13mm – one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
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