Protokollen som presenteres her gir informasjon om samtidig elektroencefalografi (EEG) og atferdsvurdering i sanntid. Vi har diskutert alle trinnene som er involvert i denne protokollen som en attraktiv løsning for forskere innen mange felt innen nevrovitenskap, spesielt innen lærings- og minneområder.
Hjernebølger amplitude oppnådd fra elektroencefalografi (EEG) har blitt anerkjent som grunnlag for kognitiv kapasitet, hukommelse og læring på dyr og mennesker. Voksen neurogenesemekanisme er også knyttet til minne og læringsforbedring. Tradisjonelt pleide forskere å vurdere lærings- og minneparametere i gnagermodeller ved atferdsoppgaver. Derfor er samtidig overvåking av atferdsendringer og EEG spesielt interessant for å korrelere data mellom hjerneaktivitet og oppgaverelatert atferd. Imidlertid er det meste av utstyret som kreves for å utføre begge studiene enten komplekst, dyrt eller bruker et kablet oppsettnettverk som hindrer de naturlige dyrenes bevegelse. I denne studien ble EEG registrert med en trådløs elektrofysiologi enhet sammen med utførelsen av en ny objektgjenkjenningsoppgave (NORT). Dyrets oppførsel ble overvåket samtidig av et videosporingssystem. Begge opptakene ble analysert offline av deres tidsstempler som ble synkronisert for å koble EEG-signaler med dyrets handlinger. Emner består av voksne Wistar-rotter etter mellomlang miljøberikelsesbehandling. Seks hodeskalleskrueelektroder ble festet parvis på begge halvkule over frontale, sentrale og parietale regioner og ble referert til en elektrode lokalisert bakre av nesebenet. NORT-protokollen består i å utsette dyret for to identiske gjenstander i 10 minutter. Etter 2 timer og 24 timer ble et av objektene erstattet med en roman. Letetiden for hvert objekt ble overvåket av en atferdssporingsprogramvare (BTS) og EEG-dataopptak. Analysen av EEG synkronisert med atferdsdata består av estimeringer av alfa og beta relativ båndkraft og sammenligninger mellom ny objektgjenkjenning versus kjent objektutforskning, mellom tre eksperimentelle stadier. I dette manuskriptet har vi diskutert elektrodeproduksjonsprosessen, epiduralelektroder implantasjonskirurgi, miljøberikelsesprotokoll, NURT-protokoll, BTS-oppsett, EEG – BTS-kobling for samtidig overvåking i sanntid og EEG-dataanalyse basert på automatisk hendelsesdeteksjon.
Atferdstest er avgjørende i nevrovitenskapelig forskning for en stor mengde informasjon generert i en in vivo sammenheng. I denne forbindelse har forskere mye brukt forskjellige atferdstester for å analysere sensorisk-motorisk funksjon, sosiale interaksjoner, angstlignende og depressiv-lignende atferd, stoffavhengighet og ulike former for kognitive funksjoner1. Manuell registrering av atferdstester kan være vanskelig, utmattende og unøyaktig selv for de fleste ekspertobservatører. Selv om det er gjort noen anstrengelser for å utvikle gratis og åpen kildekode-programvare for atferdsregistrering (f.eks. sexrat mann2-app for seksuell atferd), tillater flere alternativer automatisk og sanntids atferdsregistrering av forskjellige dyrearter fra fisk3 til gnagere 4,5,6. Videosporing er en verdifull metode for rask og nøyaktig atferdsregistrering som brukes i en rekke applikasjoner7. En mer potensiell funksjon i atferdsopptaksområdet er å utforske nevral aktivitet under atferdsmessig manifestasjon. Samtidig registrering av nevronaktivitet (fra enkeltceller til de store hjerneområdene) og atferdsoppgaver kan vise oss hvordan hjernen genererer spesifikke atferdsmønstre8. Atferd er en sekvens av mindre komponenter som kan avsløre korrelater mellom nevral aktivitet og bevegelser eller handlinger. Hvis nevronaktivitet og atferdsmønstre kunne registreres samtidig gjennom flere tidsskalaer, kunne de forklare hvordan hver hjernetilstand korrelerer med hver enkelt oppførsel (for en mer grundig undersøkelse av atferdsopptak, se Datta et al., 2019 gjennomgang8). Derfor anses synkronisert opptak av atferds- og nevronaktivitet i ønsket skala (fra nevroner til store områder av hjernen) som et ekstremt nyttig verktøy. Det er flere systemer som er ment å integrere atferdsopptak med andre målinger som nevral aktivitet 4,5.
Selv om elektroencefalografi regnes som en av de mest brukte teknikkene innen klinisk og forskningsnevrovitenskap, gjør den relativt høye mobiliteten, samt størrelsen på EEG-opptaksenheten, denne teknikken unik og utfordrende for deteksjon i tilfelle in vivo-modeller9. Noen løsninger på dette problemet har blitt utviklet, for eksempel bruk av kabler og svingbare enheter som lar dyr bevege seg fritt i arenaen. Likevel medfører kabelbaserte systemer ofte problemer for å utføre studier, for eksempel under overføring av et dyr fra ett bur til et annet, observeres hindring eller sammenfiltring av dyret med kablene. Telemetriske enheter er utviklet for trådløse elektrofysiologiske opptak for å øke fleksibiliteten i registreringssituasjonen10,11. Slike systemer har imidlertid vist betydelige begrensninger på grunn av lavt antall opptakskanaler og lav samplingsfrekvens11. I denne studien brukte vi et kommersielt tilgjengelig trådløst system som sender EEG-signaler fra dyret gjennom en Wi-Fi-forbindelse med et fritt bevegelig gnagersystem12. Apparatet veier 6 gram og står opp til 16 kanaler registrert ved 1 kSps. Dette systemet tillater EEG- eller piggopptak i dyremiljøet, med redusert forstyrrelse, og tjener som en økonomisk løsning sammenlignet med de tradisjonelle elektrofysiologiske systemene i markedet. I tillegg har vi synkronisert disse dataene ved hjelp av en videosporingsprogramvare for å gi korrelasjon mellom EEG og atferdsmønstre. Denne synkroniseringen gjøres offline ved justering og interpolering av data og hendelser basert på tidsstempler generert av begge systemene og behandles på MATLAB.
Voksen neurogenese er definert som spredning, overlevelse og differensiering i nevroner av nygenererte celler i dentate gyrus av dyr13,14. Denne prosessen er kjent for å være assosiert med minne og læringsforbedring som øker voksen neurogenese hos gnagere gjennom beriket miljø (EE) forhold15. EE består av å huse gnagere i små grupper inne i et stort bur utstyrt med leker og rør, hvor dyr har ny og kompleks, men ingen biologisk relevans15. Selv om EE stimulerer hippocampus neurogenese, varierer det også i mange faktorer som alder, dyrestamme, spesifikke stimuleringsforhold eller neurogenesedeteksjonsprosedyre. Hos middelaldrende mus eksponert for EE-boliger i syv dager, er fødsel av nye granulære celler (GC) i hippocampus dentate gyrus (DG) rapportert16. Studier som forsøker å ablate voksen nevrogenese hos voksne rotter selektivt har antydet at nye granulære celler med ca. 1-2 ukers alder er nødvendig i den lærte responsen17. Rundt 2 eller 3 uker etter at GC er født hos voksne DG, begynner flere karakteristiske trekk som dendritiske spines, som er essensielle for eksitatorisk synaptisk overføring18, å vises. Zhao et al. utførte en kvantitativ analyse for å vise at toppen av ryggradsvekst skjer i løpet av de første 3 – 4 ukene19. Flere elektrofysiologiske in vivo-studier tyder på at bare tre uker med EE-boligforhold gir endringer i DGs synaptiske overføring og øker celleeksitabiliteten20. Det har også blitt rapportert at eksponering for et beriket miljø ved 1-4 uker etter BrdU-injeksjoner økte tettheten av BrdU / NeuN-celler i DG-granulærlaget i mus21. Disse forfatterne antyder at en kritisk periode eksisterer mellom en og tre uker etter EE-eksponering siden en betydelig økning i antall nye nevroner ble observert21. Studier av voksen hippocampus neurogenese (AHN) hos mennesker har vært kontroversielle siden det ikke var direkte bevis. En nylig rapport beskrev imidlertid utviklingsstadiene av AHN i den menneskelige voksne hjernen, identifiserte tusenvis av umodne nevroner i DG, og demonstrerte dermed betydningen av AHN under aldring hos mennesker22. Basert på bevisene nevnt tidligere, er studien av AHN i dyremodeller viktigere enn noensinne (for en mer grundig undersøkelse av AHN, se Leal-Galicia et al., 2019 gjennomgang15).
Som tidligere nevnt har hippocampus vært knyttet til en grunnleggende funksjon i lærings- og minnekapasitet. Dannelsen av minner går gjennom tre forskjellige prosesser: koding (minneinnhenting), konsolidering (minnelagring) og gjenfinning (minnegjenkjenning)23. Gjenkjenningsminne hos mennesker testes ved hjelp av den visuelle parede sammenligningsoppgaven24. Grunnleggende for menneskelige og dyremodeller av minne og hukommelsestap er atferdstestene som vurderer evnen til å gjenkjenne en tidligere presentert stimuli25,26, som den visuelle parede sammenligningsoppgaven gjør hos mennesker. Derfor er en av de mest brukte atferdstestene for å vurdere en gnagers evne til å gjenkjenne en tidligere presentert stimulus, det vil si at lærings- og minnekapasiteten er den spontane nye objektgjenkjenningsoppgaven (NORT)23,27. NORT-protokollen består av to identiske nye objekter i en kjent arena i 10 min i innsamlingsforsøket. Etter en bestemt tid mellom 0 28 og48 timer29 (variabel tid i henhold til hver protokoll), returneres dyret til samme arena som inneholder et av de samme kjente objektene og ett nytt objekt. Dyret utforsker spontant det nye objektet hvis det kjente objektet ble husket26. Preferanseforholdet brukes ofte til å vurdere leteresultater. Det bestemmes ved å dele den totale objektutforskningstiden fra letetiden til romanen eller det kjente objektet. NORT har noen fordeler i forhold til andre anerkjennelsesminnetester. Viktigst av alt, det krever ingen ekstern motivasjon, belønning eller straff. Det genererer ikke stressende forhold. Endelig er det ikke nødvendig med opplæring for å fremkalle oppførselen til å utforske objektene (for en mer grundig undersøkelse av NORT, se ref.23).
Derfor er samtidig registrering av flere datamodaliteter og deres integrasjon i studiet av læring og minne, som en effekt av voksen hippocampus neurogenese, svært attraktiv og gir en overbevisende løsning for forskere på feltet. Det nåværende arbeidet vil avsløre alle prosesser som er involvert i samtidig atferdsmessig videosporingsvurdering (ny objektgjenkjenningsoppgave) og trådløs elektroencefalografiopptak. Her har vi gjennomgått elektrodeproduksjonsprosessen, epidural (skalleskrue) elektroder implantasjonskirurgi, miljøberikelsesprotokoll (for hippocampal neurogeneseinduksjon), etter NART-protokoll, BTS-oppsett, EEG – BTS-kobling for samtidig overvåking i sanntid, og EEG og atferdsdataanalyse utført på MATLAB-databehandlingsmiljø.
Atferds- og elektroencefalografiforskning er vanskelig og utfordrende av natur. Derfor presenterer kombinasjonen av begge teknikkene betydelige kritiske trinn. Dermed er begge samtidige teknikker ikke mye brukt. I praksis utfører hver gruppe rundt om i verden atferdstester med spesielle forhold, for eksempel dyr, analyserte parametere eller behandlinger. Ovennevnte skaper betydelige kontroverser på feltet og behovet for å utvikle standardprosedyrer tilgjengelig for alle. Her har vi utarbeidet denne detaljerte prosedyren med alle de kritiske trinnene og metodiske overveielsene som vanligvis ikke er beskrevet eller nevnt i de fleste publiserte artiklene. Disse er omtalt nedenfor.
Produksjon av de nødvendige materialene er et grunnleggende skritt i suksessen til denne teknikken. I denne forbindelse må elektroden bygges fra bunnen av ved hjelp av rustfritt stålskruer, kobberkabler og sølvsveiser. Disse materialene er vanskelige å sveise sammen permanent, på en slik måte at ledningsevnen og styrken til hver elektrode må verifiseres før bruk. Det er mulig å bruke en annen type ledning for elektrodeenheten; Kobberet er imidlertid fleksibelt nok til å manipulere elektroden for å sette den inn i forsterkerkontakten. I denne forbindelse er bruk av kommersielle elektroder ønskelig, men oppkjøpet kan være komplisert og dyrt. Operasjonen er et av de mest kritiske trinnene i denne protokollen. Det er sterkt anbefalt og til og med nødvendig å ha en erfaren kirurg, spesielt for elektrodeimplantasjon. Siden operasjonen ofte krever forlengelse av anestesitiden og noen ganger en sveiseapplikasjon under operasjonen, må hvert laboratorium utføre de nødvendige testene med riktig anestesi (forskjellige cocktailer kan brukes) for hver stamme av gnagere, spesielt under vivariumforhold, forskjeller mellom kull og til og med individuelle forskjeller mellom dyr. Riktig planlegging og vurdering kan forhindre at dyr mister under operasjoner. Implantasjonen av elektroder er et annet viktig skritt. Det krever stor forsiktighet for å unngå å slå skallen og skade hjernehinner eller hjernevev. Skruer skal plasseres riktig, det vil si helt fast i skallen ellers vil støy og gjenstander bli presentert på signaler, som de som er relatert til en elendig samlokalisering eller bevegelse som ikke bruker EEG-opptaket. Pre- og postoperativ behandling og forhold må alltid utføres og observeres for å unngå gnagerens lidelse. Subkutan lidokain kan brukes på hodehuden før snittet med skalpellen. En dråpe saltvann til dyrets øyne vil bidra til å forhindre tørrhet. Det må også administreres en saltoppløsning i munnen, og etter operasjonen må 1 ml administreres enten subkutant eller intraperitonealt for å kompensere dyrets væskebalanse og forhindre dehydrering. Umiddelbart etter operasjonen må en antiinflammatorisk medisinering (for å redusere smerte), samt antibiotika via subkutane eller aktuelle antibiotika, administreres direkte på periferien av hodebunnen der tannsementhetten befinner seg (for å redusere sannsynligheten for infeksjon). Gjenta prosedyren ovenfor 24 timer etter operasjonen. Plasseringen av EEG-forsterkeren på dyrets rygg er hovedproblemet for samtidig opptak. Design og produksjon av en vest er spesielt basert på dyrenes størrelse. Vesten må tillate naturlig bevegelse av gnageren (se figur 5). Dette siste vil garantere den største fordelen med teknikken, som er opptak av frie bevegelser. Siden dyrene ikke forsøkte å fjerne vesten, hodekontakten eller kablene etter operasjonen og de påfølgende dagene, ble det antatt at oppsettet ikke genererte bevegelsesbegrensning vesentlig eller forårsaket smerte eller ubehag. For en korrekt EEG-segmentering i epoker basert på hendelser merket av BTS er obligatorisk å skrive ned en veldefinert protokoll. De midlertidige merkene kan slås sammen ved hjelp av tidsseriemanipulering fordi begge systemene bruker samme klokke til å sette opp tidsstemplene. Ovennevnte utvider mulighetene for dyreforsøk som inkorporerer elektrofysiologiske data for analyse.
Teknikken som presenteres her kan brukes i ethvert nevrovitenskapelig forskningsområde og med de vanligste murinartene og til og med andre arter. Allsidigheten til Behavioral Tracking Software er en av de viktigste fordelene siden den kan brukes i en stor allsidighet av labyrinter som Morris vannlabyrint, åpent felt, ny objektgjenkjenning, betinget stedpreferanse, hullbrett, forhøyet pluss labyrint, Y-labyrint, radial armlabyrint, Barnes labyrint og andre. Den kan brukes opptil 16 kameraer samtidig. I tillegg kan hundrevis av forskjellige tiltak (for mer detaljert informasjon se håndbøkene31,32) rapporteres. Tenk på at dette arbeidet beskriver eksperimentering for EEG-opptak, noen andre teknikker som lokale feltpotensialer eller enkeltenhetsopptak er mulige. Brukerne må imidlertid ta hensyn til at det generelle oppsettet og flere forberedende trinn må endres for andre formål. Så når denne teknikken brukes sammen med EEG Wi-Fi-opptak, blir mulighetene utvidet, fordi det legger til nye perspektiver til dyreforsøk som de som utføres på mennesker for å evaluere flere egenskaper ved EEG-integrasjonen og dynamikken, som tilkobling, EEG-båndkraft eller fremkalte responser. I motsetning til mennesker er dyreforsøk mulig å evaluere legemiddeladministrasjon, genmodifikasjoner eller uttrykk, blant mange andre eksperimentelle paradigmer. For EEG-analyse, vurder at noen protokoller har et svært lavt antall repetisjoner av ønsket oppførsel, noe som begrenser muligheten til gjennomsnittlige svar og oppnå pålitelige resultater. Vær derfor nøye med å utforme opptaks- og analyseprotokollene som det anses å utføre før du begynner eksperimentet. Likevel må det tas i betraktning at arbeid i dyreforsøk ikke er mulig for å hindre bevegelse, noe som øker kompleksiteten i den eksperimentelle protokollen og hensyn til signalanalyse og atferdsoppgaver. For tiden er utstyr for fulle sporingssystemer og EEG-opptak ikke standardisert eller modulært, noe som betyr at deres oppsett er ment til en enkelt protokoll og tilpasninger for å utforske andre atferdsoppgaver, noe som innebærer / foreslår høyere kostnader for et stort antall laboratorier. Denne situasjonen kan løses ved å følge alternativene som er forklart i denne studien. Likevel kan flere forbedringer realiseres for mer pålitelige eksperimenter. Arbeidet kan forbedres på flere trinn, fra elektrodefabrikasjon gjennom atferds- og signalbehandling. Ikke desto mindre er det demonstrert at dyresporing og EEG-oppkjøp er mulig ved hjelp av et rimelig høyteknologisk, men billig oppsett.
Oppsummert er det nåværende arbeidet et forsøk på å hjelpe forskere, spesielt innen nevrovitenskapsfeltet, til å kunne bruke disse to teknikkene som ikke ofte brukes i kombinasjon. Den samtidige opptaksteknikken for EEG og atferdstesting ved hjelp av Behavioral Tracking Software har mange fordeler, og det kan være spesielt nyttig i mange felt av nevrovitenskap, spesielt i lærings- og minneområder. Tatt i betraktning at dette utstyret har andre evner som et dypt opptak av subkortikale strukturer som hippocampus, men som nevnt vil flere forberedende trinn endres. Trådløst utstyr løser nesten alle begrensningene til en konvensjonell ledningstilnærming, for eksempel dyrs mobilitetsproblemer fra ett bur til et annet, hindret eller viklet dyr inn i kablene. Denne oppsettteknikken er brukervennlig, som beskrevet ovenfor, og en nesten utrent eller ikke-spesialisert gruppe eksperter eller enkeltpersoner kan bruke denne programvaren. Prisen for EEG-utstyret er lavere enn en vanlig EEG-forsterker. Behavioral Tracking Software er også en av de rimeligste programvare for videosporing i markedet. Denne programvaren krever årlige lisenser. Utstyret kan brukes i mer enn ett eksperimentelt oppsett, forskjellige dyr og typen allsidighet. Vi håper at denne innsatsen vil hjelpe det vitenskapelige samfunnet og gi en enkel tilgang til samtidig å studere oppførsel og elektroencefalografi.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Mr. Miguel Burgos, og Mr. Gustavo Lago for å gi teknisk assistanse. Vi er takknemlige for at Stoelting Co. dekker videoproduksjonskostnadene, Jinga-hi, Inc. for å gi teknisk assistanse, og División de Investigación y Posgrado fra Universidad Iberoamericana Ciudad de México for å gi midler til dette arbeidet.
#2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
#4 Scalpel and blade | |||
50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
Camera | Logitech | c920 | |
Copper wire | |||
Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
DELL PC | DELL | ||
Electrode | |||
JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
Screws | |||
Screws equiped with electrode | |||
Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |