Un modello Xenotranest derivato dal paziente per la malformazione Venosa
Summary
Presentiamo un protocollo dettagliato per generare un modello murine xenograft di malformazione venosa. Questo modello si basa sull’iniezione sottocutanea di cellule endoteliali derivate dal paziente contenenti mutazioni genetiche TIE2 e/o PIK3CA iper-attivanti. Le lesioni dello Xenotrapianto ricapitolano da vicino le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente VM.
Abstract
La malformazione venosa (VM) è un’anomalia vascolare che deriva dallo sviluppo alterato della rete venosa con conseguente venatura dilatata e spesso disfunzionale. Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere attentamente la creazione di un modello murine xenograft che imita vm umano ed è in grado di riflettere l’eterogeneità del paziente. Le mutazioni TEK (TIE2) e PIK3CA non ereditarie iper-attivanti nelle cellule endoteliali (EC) sono state identificate come i principali fattori di allargamento della nave patologica nella VM. Il seguente protocollo descrive l’isolamento, la purificazione e l’espansione della EC derivata dal paziente che esprime il TIE2 mutante e/o PIK3CA. Questi CE vengono iniettati sottocutaneamente nella parte posteriore dei topi atimici immunodeficienti per generare canali vascolari ectatici. Le lesioni generate con LA CE mutante TIE2 o PIK3CA sono visibilmente vascolarizzate entro 7-u20129 giorni dall’iniezione e ricapitolano le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente vm. Questo modello di xenotrapianto VM fornisce una piattaforma affidabile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che guidano la formazione e l’espansione delle macchine virtuali. Inoltre, questo modello sarà strumentale per gli studi traslazionali che testano l’efficacia dei nuovi candidati ai farmaci per prevenire l’allargamento anormale delle navi visto nella VM umana.
Introduction
I difetti nello sviluppo della vascolatura sono la causa alla base di molte malattie, tra cui la malformazione venosa (VM). Vm è una malattia congenita caratterizzata da morfogenesi anormale ed espansione delle vene1. Importanti studi sul tessuto della macchina virtuale e sulle cellule endoteliali (EC) hanno identificato mutazioni di guadagno di funzione in due geni: TEK, che codifica il recettore della chinasi della tirosina TIE2, e PIK3CA, che codifica l’isoforma di p110 (sottounità catalitica) di PI3-chinasi (PI3K)2,3,4,5. Queste mutazioni somatiche si trasgrede in un’iperattivazione indipendente dal ligando delle vie di segnalazione chiave angiogenica/crescita, compreso il PI3K/AKT, con conseguente vene ectatiche dilatate3. Nonostante queste importanti scoperte genetiche, i successivi meccanismi cellulari e molecolari che innescano l’angiogenesi anormale e la formazione di canali vascolari allargati non sono ancora pienamente compresi.
Durante l’angiogenesi normale e patologica, i nuovi vasi provengono da una rete vascolare preesistente e la CE subisce una sequenza di importanti processi cellulari tra cui la proliferazione, la migrazione, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e la formazione del lume6. Le colture in vitro bidimensionali (2D/3D) della CE sono strumenti importanti per studiare ciascuna di queste proprietà cellulari singolarmente. Tuttavia, vi è una chiara richiesta di un modello murino che ricapitoli l’allargamento patologico delle navi all’interno del microambiente dell’ospite, fornendo al contempo una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica di farmaci mirati per la ricerca traslazionale.
Fino ad oggi, non è stato segnalato un modello murino transgenico di VM associato a mutazioni di guadagno di funzione TIE2. Gli attuali modelli di topo VM transgenici si basano sull’espressione onnipresente o limitata ai tessuti della mutazione attiva PIK3CA p.H1047R3,5. Questi animali transgenici forniscono informazioni significative sugli effetti specifici di tutto il corpo o dei tessuti di questa mutazione hotspot PIK3CA. La limitazione di questi modelli è la formazione di una rete vascolare altamente patologica con conseguente precoce letalità. Pertanto, questi modelli murini non riflettono pienamente l’occorrenza sporadica di eventi mutazionali e la natura localizzata della patologia della macchina virtuale.
Al contrario, i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente si basano sul trapianto o sull’iniezione di tessuto patologico o cellule derivate dai pazienti in topi immunodeficienti7. I modelli Xenotrapianto sono un potente strumento per ampliare le conoscenze sullo sviluppo della malattia e la scoperta di nuovi agentiterapeutici 8. Inoltre, l’utilizzo di cellule derivate dal paziente consente agli scienziati di ricapitolare l’eterogeneità della mutazione per studiare lo spettro dei fenotipi dei pazienti.
Qui, descriviamo un protocollo in cui la VM EC derivata dal paziente che esprime una forma mutante costitutivamente attiva di TIE2 e/o PIK3CA viene iniettata sottocutaneamente nella parte posteriore di topi nudi atimici. Le cellule vascolari iniettate sono sospese in un quadro ECM al fine di promuovere l’angiogenesi come descritto nei precedenti modelli di xenotrapianto vascolare9,10,11. Queste VM EC sono sottoposte a una significativa morfogenesi e generano vasi patologici allargati e perfuso in assenza di cellule di supporto. Il modello di xenotrapianto descritto di VM fornisce una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica dei farmaci mirati per la loro capacità di inibire l’espansione incontrollato del lume.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui viene descritto un metodo per generare un modello xenotrapianto derivato dal paziente della macchina virtuale. Questo modello murino presenta un eccellente sistema che consente ai ricercatori di ottenere una comprensione più profonda dell’allargamento del lume patologico e sarà determinante nello sviluppo di terapie più efficaci e mirate per il trattamento della VM. Questo può essere facilmente adattato per studiare altri tipi di anomalie vascolari come la malformazione venosa linfatica capillare<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Nora Lakes per la correzione delle bozze. La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Heart, Lung, and Blood Institute, sotto il premio numero R01 HL117952 (E.B.), parte del National Institutes of Health. Il contenuto è esclusivamente di competenza degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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