यह प्रोटोकॉल हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के लिए न्यूरोइंफ्लेमेटरी और हेमोडायनामिक प्रतिक्रिया को चिह्नित करने और आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन का उपयोग करके एक बहुचर प्रणाली विश्लेषण के हिस्से के रूप में इन आंकड़ों को एकीकृत करने के तरीकों को प्रस्तुत करता है।
हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोटें (एमटीबीआई) एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या हैं। एमटीबीआई के बार-बार संपर्क में आने से संचयी, लंबे समय तक चलने वाले कार्यात्मक घाटे हो सकते हैं। हमारे समूह और अन्य लोगों के कई अध्ययनों से पता चला है कि एमटीबीआई साइटोकाइन अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है और माइक्रोग्लिया को सक्रिय करता है, सेरेब्रल रक्त प्रवाह और चयापचय को कम करता है, और सेरेब्रोवास्कुलर प्रतिक्रियाशीलता को खराब करता है। इसके अलावा, कई कार्यों ने इन neuroinflammatory और हेमोडायनामिक मार्करों और संज्ञानात्मक हानि में derangements के बीच एक संबंध की सूचना दी है। इसमें हम चूहों में एमटीबीआई के लिए न्यूरोइंफ्लेमेटरी और हेमोडायनामिक ऊतक प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के तरीकों का विस्तार करते हैं। विशेष रूप से, हम वर्णन करते हैं कि एमटीबीआई के वजन-ड्रॉप मॉडल को कैसे किया जाए, एक गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल तकनीक का उपयोग करके सेरेब्रल रक्त प्रवाह को अनुदैर्ध्य रूप से कैसे मापा जाए, जिसे फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी कहा जाता है, और साइटोकिन्स और इम्युनोमोड्यूलेटरी फॉस्फो-प्रोटीन (उदाहरण के लिए, एमएपीके और एनएफबी मार्गों के भीतर) को मापने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों पर ल्यूमिनेक्स मल्टीप्लेक्स डे इम्यूनोसे कैसे किया जाए जो माइक्रोग्लिया और अन्य तंत्रिका प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिविधि का जवाब और विनियमित करते हैं। अंत में, हम इन सभी चरों के बीच संबंधों को समझने के लिए एक बहुचर सिस्टम विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करके इन डेटा को एकीकृत करने के तरीके का विवरण देते हैं। इन शारीरिक और आणविक चर के बीच संबंधों को समझना अंततः हमें एमटीबीआई के लिए जिम्मेदार तंत्र की पहचान करने में सक्षम करेगा।
सिंहावलोकन
हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोटों (एमटीबीआई) का प्रभाव ~ 1.6-3.8 मिलियन एथलीटों को सालाना1। ये चोटें, जिनमें उप-concussive और concussive चोटें शामिल हैं, रोगियों को क्षणिक शारीरिक, भावनात्मक, मनोवैज्ञानिक और संज्ञानात्मक लक्षणों के साथ छोड़ सकतीहैं। इसके अलावा, दोहराए जाने वाले एमटीबीआई (आरएमटीबीआई) “भेद्यता की खिड़की” के भीतर निरंतर संचयी गंभीरता और संज्ञानात्मक परिणामों की अवधि का कारण बन सकते हैं जो अकेले3 एकल एमटीबीआई के प्रभावों की तुलना में लंबे समय तक रहते हैं, और अंततः फ़ंक्शन 4,5,6 के स्थायी नुकसान के लिए भी। यद्यपि कई रोगी अपेक्षाकृत कम समय सीमा ( 1 महीने के लिए एमटीबीआई के लंबे समय तक चलने वाले प्रभावों का सामना करना पड़ता है, कुछ 1 वर्ष 3,7,8,9 तक रहते हैं। इन चोटों के उच्च प्रसार और स्थायी परिणामों के बावजूद, चोट तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है और कोई प्रभावी उपचार रणनीति मौजूद नहीं है।
एमटीबीआई / आरएमटीबीआई के बाद परिणामों में उच्च परिवर्तनशीलता को देखते हुए, टर्मिनल एमटीबीआई / आरएमटीबीआई अध्ययनों में प्राप्त ऊतक से प्रारंभिक चरण के आणविक ट्रिगर्स की पहचान करने में एक चुनौती अनुदैर्ध्य डेटा की कमी है जो इन आणविक ट्रिगर्स के निश्चित “तीव्र आणविक लिंक” को लंबे समय तक परिणामों के लिए प्रदर्शित करती है। इस चुनौती को दूर करने के लिए, हमारे समूह ने पाया है कि तीव्र रूप से कम सेरेब्रल रक्त प्रवाह को एक ऑप्टिकल उपकरण का उपयोग करके मापा जाता है जिसे फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (डीसीएस) कहा जाता है, आरएमटीबीआई10 के माउस मॉडल में दीर्घकालिक संज्ञानात्मक परिणाम के साथ दृढ़ता से सहसंबंधित है। इस हेमोडायनामिक बायोमार्कर का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि तीव्र रूप से कम सेरेब्रल रक्त प्रवाह वाले चूहों (और, विस्तार से, बदतर भविष्यवाणी की गई दीर्घकालिक परिणाम) के साथ चूहों में एमएपीके और एनएफबी दोनों मार्गों के भीतर न्यूरोनल फॉस्फो-सिग्नलिंग में सहवर्ती तीव्र वृद्धि होती है, प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स की न्यूरोनल अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है, और फागोसाइट / माइक्रोग्लियल मार्कर Iba1 11 की अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है। . ये डेटा न्यूरोनल फॉस्फो-सिग्नलिंग, साइटोकाइन अभिव्यक्ति और माइक्रोग्लियल सक्रियण के लिए एक संभावित भूमिका का सुझाव देते हैं, दोनों सेरेब्रल रक्त प्रवाह के बाद चोट के तीव्र विनियमन के साथ-साथ एक सिग्नलिंग कैस्केड को ट्रिगर करने में जो न्यूरोनल डिसफंक्शन और बदतर संज्ञानात्मक परिणाम की ओर जाता है। इसमें, हम आरएमटीबीआई के बाद हेमोडायनामिक और न्यूरोइंफ्लेमेटरी पर्यावरण दोनों की एक साथ जांच करने के लिए अपने दृष्टिकोण का विस्तार करते हैं और इन जटिल डेटासेट को कैसे एकीकृत करते हैं। विशेष रूप से, हम इस व्यापक दृष्टिकोण के लिए चार प्रमुख चरणों के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करते हैं: (1) हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट का एक वजन-ड्रॉप मॉडल, (2) फैलाव सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह का आकलन, (3) न्यूरोइन्फ्लेमेटरी वातावरण का परिमाणीकरण, और (4) डेटा एकीकरण (चित्रा 1)। नीचे, हम अपने तरीकों के पीछे तर्क के माध्यम से पाठकों को मार्गदर्शन करने में मदद करने के लिए इन प्रमुख चरणों में से प्रत्येक के लिए एक संक्षिप्त परिचय प्रदान करते हैं। पांडुलिपि के शेष इन प्रमुख चरणों में से प्रत्येक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के वजन-ड्रॉप मॉडल
यद्यपि दोहराए जाने वाले हल्के टीबीआई के कई उत्कृष्ट प्रीक्लिनिकल मॉडल 12,13,14,15,16,17,18 मौजूद हैं, हम एक अच्छी तरह से स्थापित और नैदानिक रूप से प्रासंगिक वजन-ड्रॉप बंद सिर की चोट मॉडल को नियोजित करते हैं। इस मॉडल की प्रमुख विशेषताओं में शामिल हैं (1) अक्षत खोपड़ी / खोपड़ी का कुंद प्रभाव गर्दन के बारे में सिर के अप्रतिबंधित रोटेशन के बाद, (2) कोई अतिरंजित संरचनात्मक मस्तिष्क की चोट, एडिमा, रक्त-मस्तिष्क बाधा क्षति, तीव्र कोशिका मृत्यु, या क्रोनिक मस्तिष्क ऊतक हानि, और (3) लगातार (1 वर्ष तक) संज्ञानात्मक घाटे जो केवल कई हिट19 (चित्रा 2) के बाद उभरते हैं।
विसरित सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह का आकलन
फैलाना सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (डीसीएस) एक गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल तकनीक है जो रक्त प्रवाहको 5,20,21 मापता है। डीसीएस में, ऊतक की सतह पर एक निकट-अवरक्त प्रकाश स्रोत रखा जाता है। एक डिटेक्टर को ऊतक की सतह पर स्रोत से एक निश्चित दूरी पर रखा जाता है ताकि प्रकाश का पता लगाया जा सके जो ऊतक के माध्यम से बिखरे हुए गुणा हो गया है (चित्र3)। चलती लाल रक्त कोशिकाओं को बंद करने से प्रकीर्णन समय के साथ पता लगाया प्रकाश तीव्रता उतार-चढ़ाव का कारण बनता है। सहसंबंध प्रसार सिद्धांत के रूप में जाना जाने वाला एक सरल विश्लेषणात्मक मॉडल इन तीव्रता के उतार-चढ़ाव को रक्त प्रवाह के सूचकांक से संबंधित करने के लिए उपयोग किया जाता है (सीबीएफआई, चित्रा 4)। यद्यपि सीबीएफआई (सेमी2 / एस) की इकाइयां प्रवाह की पारंपरिक इकाइयां नहीं हैं (एमएल / मिनट / 100 ग्राम), चूहों में एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि सीबीएफमैं एमआरआई21 लेबल वाले धमनी स्पिन द्वारा मापा गया सेरेब्रल रक्त प्रवाह के साथ दृढ़ता से संबंधित है।
संदर्भ के लिए, यहां उपयोग किए जाने वाले डीसीएस उपकरण को इन-हाउस बनाया गया था और इसमें 852 एनएम लंबी सुसंगतता-लंबाई लेजर, 4 फोटॉन गिनती हिमस्खलन फोटोडायोड की एक सरणी, और एक हार्डवेयर ऑटोकोरिलेटर बोर्ड (एकल ताऊ, 8 चैनल, 100 एनएस न्यूनतम नमूना समय) 21,22 शामिल है। डेटा LabView में लिखे गए होममेड सॉफ़्टवेयर के साथ अधिग्रहित किया जाता है। डिवाइस के लिए पशु इंटरफ़ेस में 400 μm मल्टीमोड स्रोत फाइबर (400-2200 एनएम तरंग दैर्ध्य रेंज, शुद्ध सिलिका कोर, TECS हार्ड क्लैडिंग) और 780 एनएम सिंगल मोड डिटेक्टर फाइबर (780-970 एनएम तरंग दैर्ध्य रेंज, शुद्ध सिलिका कोर, TECS हार्ड क्लैडिंग, 730 ± 30 एनएम सेकंड मोड कट-ऑफ) शामिल हैं, जो 6 मिमी के अलावा और एक काले 3 डी-मुद्रित सेंसर (4 मिमी x 8 मिमी) में एम्बेडेड है। चित्रा 3)।
तंत्रिका-ज्वलनशील वातावरण का परिमाणीकरण
यद्यपि न्यूरोइन्फ्लेमेशन को विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं द्वारा विनियमित किया जाता है, दो प्रमुख प्रासंगिक तंत्र साइटोकिन्स / केमोकाइन्स द्वारा बाह्य कोशिकीय सिग्नलिंग और फॉस्फो-प्रोटीन द्वारा इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग हैं। चोट के बाद मस्तिष्क के न्यूरोइंफ्लेमेटरी वातावरण की जांच करने के लिए, मस्तिष्क को चूहों, माइक्रोडिस्केटेड से निकाला जाता है, और साइटोकिन्स / केमोकाइन्स और फॉस्फो-प्रोटीन को ल्यूमिनेक्स (चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7) का उपयोग करके परिमाणित किया जाता है। Luminex multiplexed immunoassays एंजाइम से जुड़े immunosorbent assays (ELISAs) को फ्लोरोसेंटली टैग किए गए चुंबकीय मोतियों के युग्मन द्वारा इन प्रोटीनों के एक विविध संग्रह के एक साथ परिमाणीकरण को सक्षम करते हैं। ब्याज के प्रत्येक प्रोटीन के लिए अलग-अलग फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग किया जाता है, और प्रत्येक टैग के मोतियों को उस विशेष प्रोटीन के खिलाफ कैप्चर एंटीबॉडी के साथ कार्यात्मक किया जाता है। प्रत्येक प्रोटीन को कैप्चर करने के लिए सैकड़ों मोतियों को एक साथ मिलाया जाता है, 96 अच्छी तरह से प्लेट में रखा जाता है, और नमूने के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। नमूना इनक्यूबेशन के बाद, एक चुंबक का उपयोग मोतियों को कुएं में फंसाने के लिए किया जाता है जबकि नमूने को धोया जाता है। इसके बाद, बायोटिनिलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी पारंपरिक एलिसा के समान एंटीबॉडी-एंटीजन सैंडविच बनाने के लिए ब्याज के विश्लेषक को बांधता है, लेकिन प्रत्येक प्रोटीन के लिए एलिसा के साथ एक अलग फ्लोरोसेंटली टैग किए गए मनका पर होता है। phycoerythrin-संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन (SAPE) जोड़ने से प्रत्येक प्रतिक्रिया पूरी होती है। Luminex उपकरण तब मोतियों को पढ़ता है और प्रत्येक फ्लोरोसेंट टैग / प्रोटीन के अनुसार संकेत को अलग करता है।
डेटा एकीकरण
ल्यूमिनेक्स परख में मापा गया बड़ी संख्या में एनालिट्स (जैसे, साइटोकिन्स) के कारण, डेटा विश्लेषण की व्याख्या करना मुश्किल हो सकता है यदि प्रत्येक मात्रा प्रोटीन का व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जाता है। विश्लेषण को सरल बनाने और analytes के बीच देखे गए रुझानों को कैप्चर करने के लिए, हम आंशिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन (PLSR, चित्रा 8) 23 नामक एक बहुचर विश्लेषण विधि का उपयोग करते हैं। PLSR प्रत्येक मापा प्रोटीन (यानी, साइटोकिन्स या फॉस्फो-प्रोटीन, जिसे “भविष्यवक्ता चर” के रूप में जाना जाता है) के अनुरूप वजन की एक धुरी की पहचान करके काम करता है, जो एक साथ एक प्रतिक्रिया चर (जैसे, सेरेब्रल रक्त प्रवाह) के साथ मापा प्रोटीन के सह-विचरण की बेहतर व्याख्या करता है। वजन को “लोडिंग” के रूप में संदर्भित किया जाता है और एक वेक्टर में इकट्ठा किया जाता है जिसे अव्यक्त चर (एलवी) के रूप में जाना जाता है। दो एलवी में से प्रत्येक पर मापा गया प्रोटीन डेटा प्रोजेक्ट करके (जिसे “स्कोरिंग” के रूप में संदर्भित किया जाता है), डेटा को इन एलवी के संदर्भ में फिर से प्लॉट किया जा सकता है। PLSR की गणना करने के बाद, हम एक नए LV की पहचान करने के लिए एक varimax रोटेशन का उपयोग करते हैं जो LV और predictor variable24 पर नमूना अनुमानों के बीच सहप्रसरण को अधिकतम करता है। यह दृष्टिकोण हमें LV1 को अक्ष के रूप में परिभाषित करने की अनुमति देता है जिसके लिए प्रतिक्रिया चर के विचरण को सबसे अच्छा समझाया गया है। एलवी 2 प्रतिक्रिया चर और एलवी 1 अवशिष्ट डेटा के बीच सह-विचरण को अधिकतम करता है, जो नमूनों के बीच जैविक या तकनीकी परिवर्तनशीलता से जुड़ा हो सकता है। अंत में, हम यह सुनिश्चित करने के लिए एक लीव वन आउट क्रॉस सत्यापन (LOOCV) का संचालन करते हैं कि PLSR मॉडल किसी भी एक नमूने23 पर बहुत अधिक निर्भर नहीं है।
इस प्रोटोकॉल में, हम एमटीबीआई के लिए न्यूरोइंफ्लेमेटरी और हेमोडायनामिक ऊतक प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के तरीकों का विस्तार करते हैं। सामान्य वर्कफ़्लो चित्र 1 में उल्लिखित है. इस प्रोटोकॉल में, चूहों को वजन-ड्रॉप बंद सिर की चोट मॉडल का उपयोग करके एक या अधिक एमटीबीआई के अधीन किया जाता है। सेरेब्रल रक्त प्रवाह को चोट से पहले और कई समय बिंदुओं पर अनुदैर्ध्य रूप से मापा जाता है। न्यूरोइंफ्लेमेटरी परिवर्तनों की पूछताछ के लिए ब्याज के समय, जानवर को euthanized है, और मस्तिष्क निकाला जाता है। ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों को माइक्रोडिसेक्शन के माध्यम से अलग किया जाता है और फिर प्रोटीन निकालने के लिए झूठ बोला जाता है। लिसेट का उपयोग तब साइटोकाइन और फॉस्फो-प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ-साथ पश्चिमी धब्बा के ल्यूमिनेक्स मल्टीप्लेक्स किए गए इम्युनोएसेस दोनों के लिए किया जाता है। अंत में, इस समग्र डेटासेट को आंशिक रूप से कम से कम वर्ग प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके एकीकृत किया जाता है।
यहां हम दोहराए जाने वाले हल्के दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के लिए हेमोडायनामिक और न्यूरोइंफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया के आकलन के लिए विधियों का विस्तार करते हैं। इसके अलावा, हमने दिखाया है कि आंशिक कम से कम वर?…
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान R21 NS104801 (EMB) और R01 NS115994 (LBW / EB) और अटलांटा जूनियर फैकल्टी फोकस्ड अवार्ड (EMB) के बच्चों की हेल्थकेयर द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को अमेरिकी रक्षा विभाग द्वारा कांग्रेस के निर्देशित चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रमों के माध्यम से पुरस्कार संख्या के तहत भी समर्थित किया गया था। W81XWH-18-1-0669 (LBW/ राय, व्याख्याएं, निष्कर्ष और सिफारिशें लेखक की हैं और जरूरी नहीं कि रक्षा विभाग द्वारा समर्थित हों। यह सामग्री अनुदान संख्या 1937971 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम द्वारा समर्थित काम पर आधारित है। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, और निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित करें।
Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
Depilatory cream | Amazon | Nair | |
DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
LabView | National Instruments | LabVIEW | |
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
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Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
R Programming Language | |||
RStudio | www.rstudio.com | ||
Sonicator | |||
Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |