Analisi dei sistemi della risposta neuroinfiammatoria ed emodinamica alla lesione cerebrale traumatica
Summary
Questo protocollo presenta metodi per caratterizzare la risposta neuroinfiammatoria ed emodinamica a lesioni cerebrali traumatiche lievi e per integrare questi dati come parte di un’analisi di sistemi multivariati utilizzando la regressione parziale dei minimi quadrati.
Abstract
Le lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI) sono un problema significativo di salute pubblica. L’esposizione ripetuta a mTBI può portare a deficit funzionali cumulativi e di lunga durata. Numerosi studi del nostro gruppo e di altri hanno dimostrato che mTBI stimola l’espressione delle citochine e attiva la microglia, diminuisce il flusso sanguigno cerebrale e il metabolismo e compromette la reattività cerebrovascolare. Inoltre, diversi lavori hanno riportato un’associazione tra squilibri in questi marcatori neuroinfiammatori ed emodinamici e deficit cognitivi. Qui descriviamo in dettaglio i metodi per caratterizzare la risposta del tessuto neuroinfiammatorio ed emodinamico a mTBI nei topi. In particolare, descriviamo come eseguire un modello di caduta di peso di mTBI, come misurare longitudinalmente il flusso sanguigno cerebrale utilizzando una tecnica ottica non invasiva chiamata spettroscopia di correlazione diffusa e come eseguire un test immunologico multiplexed Luminex su campioni di tessuto cerebrale per quantificare citochine e fosfoproteine immunomodulatorie (ad esempio, all’interno delle vie MAPK e NFκB) che rispondono e regolano l’attività della microglia e di altre cellule immunitarie neurali. Infine, descriviamo in dettaglio come integrare questi dati utilizzando un approccio di analisi dei sistemi multivariati per comprendere le relazioni tra tutte queste variabili. Comprendere le relazioni tra queste variabili fisiologiche e molecolari ci consentirà in ultima analisi di identificare i meccanismi responsabili dell’mTBI.
Introduction
Panoramica
Lievi lesioni cerebrali traumatiche (mTBI) hanno un impatto ~ 1,6-3,8 milioni di atleti all’anno1. Queste lesioni, comprese le lesioni sub-concussive e concussive, possono lasciare i pazienti con sintomi fisici, emotivi, psicologici e cognitivi transitori2. Inoltre, l’mTBI ripetitivo (rmTBI) sostenuto all’interno di una “finestra di vulnerabilità” può portare a gravità cumulativa e durata delle conseguenze cognitive che durano più a lungo degli effetti di un singolo mTBI da solo3 e, in definitiva, anche alla perdita permanente della funzione 4,5,6. Sebbene molti pazienti guariscano in un lasso di tempo relativamente breve ( 1 mese, con alcuni che durano fino a 1 anno 3,7,8,9. Nonostante l’elevata prevalenza e le conseguenze durature di queste lesioni, i meccanismi di lesione sono poco conosciuti e non esistono strategie di trattamento efficaci.
Data l’elevata variabilità degli esiti dopo mTBI/rmTBI, una sfida nell’identificare i trigger molecolari in fase iniziale dal tessuto ottenuto negli studi terminali mTBI/rmTBI è la mancanza di dati longitudinali che dimostrino i “legami molecolari acuti” definitivi di questi trigger molecolari a esiti a lungo termine. Per superare questa sfida, il nostro gruppo ha scoperto che il flusso sanguigno cerebrale acutamente ridotto misurato acutamente utilizzando uno strumento ottico chiamato spettroscopia di correlazione diffusa (DCS), è fortemente correlato con l’esito cognitivo a lungo termine in un modello murino di rmTBI10. Utilizzando questo biomarcatore emodinamico, abbiamo dimostrato che i topi con un flusso sanguigno cerebrale acutamente basso (e, per estensione, un esito a lungo termine peggiore previsto) hanno concomitanti aumenti acuti della segnalazione fosfo neuronale all’interno delle vie MAPK e NFκB, aumenti dell’espressione neuronale delle citochine pro-infiammatorie e aumenti dell’espressione del fagocita/marcatore microgliale Iba111 . Questi dati suggeriscono un possibile ruolo per la segnalazione fosfo-neuronale, l’espressione di citochine e l’attivazione microgliale sia nella regolazione acuta del flusso sanguigno cerebrale dopo la lesione, sia nell’innescare una cascata di segnalazione che porta a disfunzioni neuronali e peggior esito cognitivo. Qui, descriviamo in dettaglio il nostro approccio per sondare simultaneamente sia l’ambiente emodinamico che neuroinfiammatorio dopo rmTBI e come integrare questi set di dati complessi. In particolare, delineiamo le procedure per quattro passaggi chiave di questo approccio globale: (1) un modello di caduta di peso di lieve lesione cerebrale traumatica, (2) valutazione del flusso sanguigno cerebrale con spettroscopia di correlazione diffusa, (3) quantificazione dell’ambiente neuroinfiammatorio e (4) integrazione dei dati (Figura 1). Di seguito, forniamo una breve introduzione a ciascuno di questi passaggi chiave per aiutare a guidare i lettori attraverso la logica alla base dei nostri metodi. Il resto del manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per ciascuno di questi passaggi chiave.
Modello di calo di peso di lieve lesione cerebrale traumatica
Sebbene esistano molti eccellenti modelli preclinici di TBI lieve ripetitivo 12,13,14,15,16,17,18, impieghiamo un modello di trauma cranico chiuso a caduta di peso ben consolidato e clinicamente rilevante. Le caratteristiche principali di questo modello includono (1) impatto smussato del cranio / cuoio capelluto intatto seguito da rotazione illimitata della testa attorno al collo, (2) nessuna lesione cerebrale strutturale evidente, edema, danno da barriera emato-encefalica, morte cellulare acuta o perdita cronica del tessuto cerebrale e (3) deficit cognitivi persistenti (fino a 1 anno) che emergono solo dopo più colpi19 (Figura 2).
Valutazione del flusso sanguigno cerebrale con spettroscopia di correlazione diffusa
La spettroscopia di correlazione diffusa (DCS) è una tecnica ottica non invasiva che misura il flussosanguigno 5,20,21. In DCS, una sorgente di luce nel vicino infrarosso viene posizionata sulla superficie del tessuto. Un rilevatore viene posizionato a una distanza fissa dalla sorgente sulla superficie del tessuto per rilevare la luce che si è moltiplicata dispersa attraverso il tessuto (Figura 3). La dispersione dei globuli rossi in movimento fa sì che l’intensità della luce rilevata fluttui nel tempo. Un semplice modello analitico noto come teoria della diffusione della correlazione viene utilizzato per correlare queste fluttuazioni di intensità a un indice di flusso sanguigno (CBFi, Figura 4). Sebbene le unità di CBFi (cm2/s) non siano le tradizionali unità di flusso (mL/min/100 g), uno studio precedente sui topi ha dimostrato che il CBFi è fortemente correlato al flusso sanguigno cerebrale misurato mediante spin arterioso marcato MRI21.
Per riferimento, lo strumento DCS utilizzato qui è stato costruito internamente ed è composto da un laser a lunghezza di coerenza lunga 852 nm, una serie di 4 fotodiodi a valanga di conteggio dei fotoni e una scheda autocorrelatore hardware (singola tau, 8 canali, 100 ns tempo minimo di campionamento)21,22. I dati vengono acquisiti con software fatti in casa scritti in LabView. L’interfaccia animale per il dispositivo è costituita da una fibra sorgente multimodale da 400 μm (gamma di lunghezze d’onda 400-2200 nm, nucleo di silice pura, rivestimento rigido TECS) e una fibra del rilevatore monomodale da 780 nm (gamma di lunghezze d’onda 780-970 nm, nucleo di silice pura, rivestimento rigido TECS, 730 ± taglio della seconda modalità a 30 nm) distanziati di 6 mm e incorporati in un sensore nero stampato in 3D (4 mm x 8 mm, Figura 3).
Quantificazione dell’ambiente neuroinfiammatorio
Sebbene la neuroinfiammazione sia regolata da diversi processi cellulari, due meccanismi chiave rilevanti sono la segnalazione extracellulare da parte di citochine / chemochine e la segnalazione intracellulare da parte di fosfoproteine. Per studiare l’ambiente neuroinfiammatorio del cervello post-lesione, i cervelli vengono estratti da topi, microsezionati e citochine / chemochine e fosfoproteine vengono quantificate usando Luminex (Figura 5, Figura 6, Figura 7). I saggi immunologici multiplexed Luminex consentono la quantificazione simultanea di una collezione diversificata di queste proteine accoppiando saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA) a perline magnetiche marcate fluorescentmente. Per ogni proteina di interesse vengono utilizzati tag fluorescenti distinti e le perline di ciascun tag sono funzionalizzate con un anticorpo di cattura contro quella particolare proteina. Centinaia di perline per catturare ogni proteina vengono mescolate insieme, poste in una piastra da 96 pozzetti e incubate con il campione. Dopo l’incubazione del campione, viene utilizzato un magnete per intrappolare le perline nel pozzo mentre il campione viene lavato via. Successivamente, l’anticorpo di rilevamento biotinilato si lega all’analita di interesse per formare un sandwich anticorpo-antigene simile a un ELISA tradizionale, ma con l’ELISA per ogni proteina che si verifica su un diverso tallone marcato fluorescentemente. L’aggiunta di streptavidina coniugata con ficoeritrina (SAPE) completa ogni reazione. Lo strumento Luminex legge quindi le perline e separa il segnale in base a ciascun tag/proteina fluorescente.
Integrazione dei dati
A causa del gran numero di analiti (ad esempio, citochine) misurati nel test Luminex, l’analisi dei dati può essere difficile da interpretare se ogni proteina quantificata viene analizzata individualmente. Per semplificare l’analisi e catturare le tendenze osservate tra gli analiti, utilizziamo un metodo di analisi multivariata chiamato regressione parziale dei minimi quadrati (PLSR, Figura 8)23. PlSR funziona identificando un asse di pesi corrispondente a ciascuna proteina misurata (cioè citochine o fosfo-proteine, denominate “variabili predittive”) che insieme spiegano in modo ottimale la co-varianza delle proteine misurate con una variabile di risposta (ad esempio, flusso sanguigno cerebrale). I pesi sono indicati come “carichi” e sono assemblati in un vettore noto come variabile latente (LV). Proiettando (indicato come “punteggio”) i dati proteici misurati su ciascuno dei due LV, i dati possono essere ritracciati in termini di questi LV. Dopo aver calcolato il PLSR, utilizziamo una rotazione varimax per identificare un nuovo LV che massimizza la covarianza tra le proiezioni del campione sul LV e la variabile predittiva24. Questo approccio ci consente di definire LV1 come l’asse per il quale viene spiegata al meglio la varianza della variabile di risposta. LV2 massimizza la co-varianza tra la variabile di risposta e i dati residui di LV1, che possono essere associati alla variabilità biologica o tecnica tra i campioni. Infine, conduciamo una Convalida incrociata Leave One Out (LOOCV) per garantire che il modello PLSR non dipenda fortemente da un campione23.
In questo protocollo, dettagliamo i metodi per caratterizzare la risposta del tessuto neuroinfiammatorio ed emodinamico a mTBI. Il flusso di lavoro generale è descritto nella Figura 1. In questo protocollo, i topi sono soggetti a uno o più mTBI utilizzando un modello di trauma cranico chiuso a goccia di peso. Il flusso sanguigno cerebrale viene misurato longitudinalmente prima e in più punti temporali dopo l’infortunio. Nel momento di interesse per l’interrogazione dei cambiamenti neuroinfiammatori, l’animale viene eutanasia e il cervello viene estratto. Le regioni cerebrali di interesse sono isolate tramite microdissezione e quindi lisate per estrarre proteine. I lisati vengono quindi utilizzati sia per i saggi immunologici multiplexati Luminex di espressione di citochine e fosfoproteine, sia per Western blot. Infine, questo set di dati olistico è integrato utilizzando un’analisi di regressione parziale dei minimi quadrati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo in dettaglio i metodi per la valutazione della risposta emodinamica e neuroinfiammatoria a lesioni cerebrali traumatiche lievi ripetitive. Inoltre, abbiamo mostrato come integrare questi dati come parte di un’analisi di sistemi multivariati utilizzando la regressione parziale dei minimi quadrati. Nel testo seguente discuteremo alcuni dei passaggi chiave e delle limitazioni associate al protocollo, nonché i vantaggi / svantaggi dei metodi rispetto ai metodi esistenti.
M…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto dal National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) e R01 NS115994 (LBW / EB) e Children’s Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Questo lavoro è stato anche sostenuto dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti attraverso i programmi di ricerca medica diretti dal Congresso sotto il premio n. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle dell’autore e non sono necessariamente approvate dal Dipartimento della Difesa. Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program nell’ambito della sovvenzione n. 1937971. Eventuali opinioni, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
References
- Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).
- Iraji, A., et al. Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses. Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).
- Guskiewicz, K. M., et al. Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study. Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
- Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. . Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture. , (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury – an Update. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport–the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).
- Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).
- Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients. PLoS ONE. 10 (8), 0134019 (2015).
- Buckley, E. M., et al. Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).
- Sankar, S. B., et al. Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury. Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).
- Vagnozzi, R., et al. Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment–part I. Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).
- Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).
- Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage. Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality. Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).
- Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).
- Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. Concussion in professional football: animal model of brain injury–part 15. Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).
- Durduran, T., Yodh, A. G. Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement. NeuroImage. 85, 51-63 (2014).
- Sathialingam, E., et al. Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents. Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719 (2018).
- Lee, S. Y., et al. Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease. Neurophotonics. 6 (03), 1 (2019).
- Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation. Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).
- Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications. Umetrics Academy. , (2013).
- Conzen, P. F., et al. Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats. Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).
- Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. Diffuse optics for tissue monitoring and tomography. Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701 (2010).
- Lee, S. Y., et al. Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).
- . plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models Available from: https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm (2019)
- White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. Imaging of functional connectivity in the mouse brain. PLoS One. 6, 16322 (2011).
- Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects. Neurophotonics. 1 (1), 011009 (2014).
- Rowan, O., et al. Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy. Neurophotonics. 8 (1), (2021).
- Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).
- Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).
- Gierut, J. J., et al. Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium. Science Signaling. 8 (407), 129 (2015).
