Análise de Sistemas da Resposta Neuroinflammatória e Hemodinâmica à Lesão Cerebral Traumática
Summary
Este protocolo apresenta métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica à lesão cerebral traumática leve e integrar esses dados como parte de uma análise de sistemas multivariados utilizando regressão parcial de quadrados.
Abstract
Lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) são um problema significativo de saúde pública. A exposição repetida ao mTBI pode levar a déficits funcionais cumulativos e duradouros. Inúmeros estudos do nosso grupo e outros mostraram que o mTBI estimula a expressão da citocina e ativa a microglia, diminui o fluxo sanguíneo cerebral e o metabolismo, e prejudica a reatividade cerebrovascular. Além disso, vários trabalhos têm relatado associação entre desarranjos nesses marcadores neuroinflammatórios e hemodinâmicos e prejuízos cognitivos. Aqui detalhamos métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica ao mTBI em camundongos. Especificamente, descrevemos como executar um modelo de queda de peso de mTBI, como medir longitudinalmente o fluxo sanguíneo cerebral usando uma técnica óptica não invasiva chamada espectroscopia de correlação difusa, e como realizar um imunoensaio multiplexado Luminex em amostras de tecido cerebral para quantificar citocinas e proteínas mifosias imunomodulatórias (por exemplo, dentro das vias MAPK e NFκB) que respondem e regulam a atividade de microglia e outras células imunes neurais. Por fim, detalhamos como integrar esses dados utilizando uma abordagem de análise de sistemas multivariados para entender as relações entre todas essas variáveis. Compreender as relações entre essas variáveis fisiológicas e moleculares nos permitirá, em última análise, identificar mecanismos responsáveis pelo MTBI.
Introduction
Visão geral
Lesões cerebrais traumáticas leves (mTBIs) impactam ~1,6-3,8 milhões de atletas anualmente1. Essas lesões, incluindo lesões sub-concussivas e concussivas, podem deixar os pacientes com sintomas físicos, emocionais, psicológicos e cognitivos transitórios2. Além disso, o mTBI repetitivo (rmTBI) sustentado dentro de uma “janela de vulnerabilidade” pode levar à gravidade cumulativa e duração de consequências cognitivas que duram mais do que os efeitos de um único mTBIsozinho 3, e, em última instância, até mesmo para perda permanente da função 4,5,6. Embora muitos pacientes se recuperem em um período relativamente curto ( 1 mês, com alguns durando até 1 ano 3,7,8,9. Apesar da alta prevalência e das consequências duradouras dessas lesões, os mecanismos de lesão são mal compreendidos e não existem estratégias eficazes de tratamento.
Dada a alta variabilidade nos resultados após o mTBI/rmTBI, um desafio na identificação de gatilhos moleculares em estágio inicial a partir de tecidos obtidos em estudos terminais de mTBI/rmTBI é a falta de dados longitudinais demonstrando “ligações moleculares agudas” definitivas desses gatilhos moleculares para desfechos de longo prazo. Para superar esse desafio, nosso grupo descobriu que o fluxo sanguíneo cerebral reduzido agudamente medido agudamente usando uma ferramenta óptica chamada espectroscopia de correlação difusa (DCS), correlaciona fortemente com o desfecho cognitivo de longo prazo em um modelo de camundongo de rmTBI10. Usando este biomarcador hemodinâmico, mostramos que camundongos com fluxo sanguíneo cerebral agudamente baixo (e, por extensão, pior resultado previsto a longo prazo) têm aumentos agudos concomitantes na sinalização de fosfo neuronal dentro das vias MAPK e NFκB, aumentos na expressão neuronal de citocinas pró-inflamatórias e aumentos na expressão do marcador de fagocite/microglialIba111 . Esses dados sugerem um possível papel para a sinalização neuronal, expressão citocina e ativação microglial tanto na regulação aguda do fluxo sanguíneo cerebral pós lesão como no desencadeamento de uma cascata de sinalização que leva a disfunção neuronal e pior desfecho cognitivo. Aqui, detalhamos nossa abordagem para sondar simultaneamente o ambiente hemodinâmico e neuroinflamatório após o RMTBI e como integrar esses complexos conjuntos de dados. Especificamente, delineamos procedimentos para quatro passos-chave para esta abordagem abrangente: (1) um modelo de queda de peso de lesão cerebral traumática leve, (2) avaliação do fluxo sanguíneo cerebral com espectroscopia de correlação difusa, (3) quantificação do ambiente neuroinflamatório e (4) integração de dados (Figura 1). Abaixo, fornecemos uma breve introdução a cada um desses passos-chave para ajudar a orientar os leitores através da lógica por trás de nossos métodos. O restante do manuscrito fornece um protocolo detalhado para cada uma dessas etapas-chave.
Modelo de queda de peso de lesão cerebral traumática leve
Embora muitos excelentes modelos pré-clínicos de TCE leve repetitivo existam 12,13,14,15,16,17,18, empregamos um modelo de lesão de cabeça fechada bem estabelecido e clinicamente relevante. As principais características deste modelo incluem (1) impacto contundente do crânio/couro cabeludo intacto seguido de rotação irrestrita da cabeça sobre o pescoço, (2) nenhuma lesão cerebral estrutural aberta, edema, dano de barreira hematoencefálica, morte celular aguda ou perda crônica do tecido cerebral, e (3) déficits cognitivos persistentes (até 1 ano) que surgem somente após múltiplos acertos19 (Figura 2).
Avaliação do fluxo sanguíneo cerebral com espectroscopia de correlação difusa
Espectroscopia de correlação difusa (DCS) é uma técnica óptica não invasiva que mede o fluxo sanguíneo 5,20,21. Em DCS, uma fonte de luz quase infravermelha é colocada na superfície do tecido. Um detector é colocado a uma distância fixa da fonte na superfície do tecido para detectar a luz que se multiplica espalhada pelo tecido (Figura 3). A dispersão dos glóbulos vermelhos em movimento faz com que a intensidade da luz detectada flutue com o tempo. Um modelo analítico simples conhecido como teoria da difusão de correlação é usado para relacionar essas flutuações de intensidade a um índice de fluxo sanguíneo (CBFi, Figura 4). Embora as unidades da CBFi (cm2/s) não sejam as unidades tradicionais de fluxo (mL/min/100 g), estudo prévio em camundongos mostrou quea CBF se correlaciona fortemente com o fluxo sanguíneo cerebral medido pela ressonância magnética arterial rotulada21.
Para referência, o instrumento DCS utilizado aqui foi construído internamente e é composto por um laser de coerência de 852 nm de comprimento de coerência, uma matriz de 4 fótons contando fotodiodos avalanche, e uma placa de autocorrelador de hardware (tau único, 8 canais, tempo mínimo de amostra de 100 ns)21,22. Os dados são adquiridos com software caseiro escrito no LabView. A interface animal para o dispositivo consiste em uma fibra de origem multimoda de 400 μm (400-2200 nm de comprimento de onda, núcleo de sílica pura, tecs hard cladding) e um detector de modo único de 780 nm (780-970 nm de comprimento de onda, núcleo de sílica pura, tecs hard cladding, 730 ± 30 nm segundo modo de corte) espaçado 6 mm de distância e embutido em um sensor preto impresso em 3D (4 mm x 8 mm, Figura 3).
Quantificação do ambiente neuroinflamatório
Embora a neuroinflamação seja regulada por diversos processos celulares, dois mecanismos relevantes principais são a sinalização extracelular por citocinas/quimiocinas e sinalização intracelular por fosfo-proteínas. Para investigar o ambiente neuroinflamatório do cérebro pós-lesão, os cérebros são extraídos de camundongos, microdissectados, e citocinas/quimiocinas e fosfo-proteínas são quantificadas usando Luminex (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Os imunoassedos multiplexados Luminex permitem quantificação simultânea de uma coleção diversificada dessas proteínas, acoplando ensaios imunosorentes ligados a enzimas (ELISAs) a contas magnéticas marcadas fluorescentemente. Etiquetas fluorescentes distintas são usadas para cada proteína de interesse, e contas de cada tag são funcionalizadas com um anticorpo de captura contra essa proteína em particular. Centenas de contas para capturar cada proteína são misturadas, colocadas em uma placa de 96 poços, e incubadas com amostra. Após a incubação da amostra, um ímã é usado para prender as contas no poço enquanto a amostra é lavada. Em seguida, o anticorpo de detecção biotiningada liga-se ao analito de interesse para formar um sanduíche de anticorpo-antígeno semelhante a um ELISA tradicional, mas com o ELISA para cada proteína ocorrendo em uma conta fluorescente diferente marcada fluorescente. Adicionar streptavidina conjugado por ficoerythrin (SAPE) completa cada reação. O instrumento Luminex então lê as contas e separa o sinal de acordo com cada tag/proteína fluorescente.
Integração de dados
Devido ao grande número de analitos (por exemplo, citocinas) medidos no ensaio luminex, a análise de dados pode ser difícil de interpretar se cada proteína quantificada for analisada individualmente. Para simplificar a análise e capturar tendências observadas entre os analitos, utilizamos um método de análise multivariada chamado regressão parcial de quadrados (PLSR, Figura 8)23. A PLSR funciona identificando um eixo de pesos correspondente a cada proteína medida (ou seja, citocinas ou fosforas, referidas como “variáveis preditoras”) que, juntas, explicam a covariância das proteínas medidas com uma variável de resposta (por exemplo, fluxo sanguíneo cerebral). Os pesos são chamados de “carregamentos” e são montados em um vetor conhecido como uma variável latente (LV). Ao projetar (chamados de “pontuação”) os dados de proteína medidos em cada um dos dois LVs, os dados podem ser re-plotados em termos desses LVs. Após a computação do PLSR, usamos uma rotação varimax para identificar um novo LV que maximiza a covariância entre as projeções amostrais na LV e a variávelpreditor 24. Essa abordagem nos permite definir o LV1 como o eixo para o qual a variância da variável de resposta é melhor explicada. O LV2 maximiza a covariância entre a variável de resposta e os dados residuais LV1, que podem estar associados à variabilidade biológica ou técnica entre as amostras. Por fim, realizamos uma Validação De Uma Saída fora de Ristração (LOOCV) para garantir que o modelo PLSR não dependa fortemente de nenhuma amostra23.
Neste protocolo, detalhamos métodos para caracterizar a resposta neuroinflammatória e hemodinâmica ao mTBI. O fluxo de trabalho geral está descrito na Figura 1. Neste protocolo, os camundongos estão sujeitos a um ou mais mTBIs usando um modelo de lesão na cabeça fechada com queda de peso. O fluxo sanguíneo cerebral é medido longitudinalmente antes e em vários pontos de tempo após a lesão. No momento de interesse para interrogatório de alterações neuroinflamatórias, o animal é eutanizado, e o cérebro é extraído. As regiões de interesse cerebrais são isoladas por microdisseção e, em seguida, lístidas para extrair proteína. Os lysatos são então usados tanto para imunoensatos multiplexados Luminex de citocina e expressão fosfo-proteína, bem como para a mancha ocidental. Finalmente, este conjunto de dados holístico é integrado usando uma análise parcial de regressão de quadrados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui detalhamos métodos para avaliação da resposta hemodinâmica e neuroinflamatória à lesão cerebral traumática leve repetitiva. Além disso, mostramos como integrar esses dados como parte de uma análise de sistemas multivariados usando regressão parcial de quadrados. No texto abaixo discutiremos algumas das principais etapas e limitações associadas ao protocolo, bem como as vantagens/desvantagens dos métodos sobre os métodos existentes.
Modelo de queda de peso de lesão …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde R21 NS104801 (EMB) e R01 NS115994 (LBW/EB) e Pelo Prêmio Focado na Saúde Infantil de Atlanta Junior Faculty Focused (EMB). Este trabalho também foi apoiado pelo Departamento de Defesa dos EUA através dos Programas de Pesquisa Médica Dirigidos pelo Congresso sob o Prêmio Nº. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este material é baseado em trabalho apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência sob o grant no. 1937971. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.
Materials
| Adjustable pipettes | any adjustable pipette | ||
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Bio-Plex cell lysis kit | C Bio-Rad | 171304012 | |
| BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile | BrandTech | 781602 96 | |
| Complete mini protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| Depilatory cream | Amazon | Nair | |
| DiH2O | VWR | VWRL0200-1000 | |
| Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates | Millipore Sigma Catalogue | 40-285 | |
| Hardware Autocorrelator Board | www.correlator.com | Flex05-8ch | |
| Isoflurane 250 mL | MED-VET INTERNATIONAL | RXISO-250 | |
| Kimwipe (11.2 x 21.3 cm) | VWR | 21905-026 | |
| Laboratory vortex mixer | VWR | 10153-838 | |
| LabView | National Instruments | LabVIEW | |
| Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software | Luminex Corporation | ||
| Luminex Drive Fluid | Luminex | MPXDF-4PK | |
| Luminex sheath fluid | EMD Millipore | SHEATHFLUID | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Premixed 32 Plex – Immunology Multiplex Assay | Millipore Sigma | MCYTMAG-70K-PX32 | |
| MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay | Millipore Sigma | 48-660MAG | |
| Mini LabRoller rotator | VWR | 10136-084 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626-1G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | VWR | 97064-158 | |
| Plate Sealer | VWR | 82050-992 | |
| Polypropylene microfuge tubes | VWR | 20901-547 | |
| Mini LabRoller | Millipore Sigma | Z674591 | |
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-668 | |
| R Programming Language | |||
| RStudio | www.rstudio.com | ||
| Sonicator | |||
| Titer plate shaker | VWR | 12620-926 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| 1 m acrylic guide tube | McMaster-Carr | 49035K85 | |
| 4 photon counting avalanche photodiode | Perkin-Elmer | SPCM-AQ4C-IO | |
| 400 um multimode source fiber | Thorlabs Inc. | FT-400-EMT | |
| 54 g bolt | Ace Hardware | 0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length | |
| 780 nm single mode detector fiber | Thorlabs Inc. | 780HP | |
| 852 nm long-coherence length laser | TOPTICA Photonics | iBeam smart |
References
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