Bildebehandling og kvantifisering av området av hurtiggående mikrobobler ved hjelp av et høyhastighetskamera og bildeanalyse

Summary

Kavitasjonsmikrobobler avbildet ved hjelp av et høyhastighetskamera festet til et zoomobjektiv. Det eksperimentelle oppsettet forklares, og bildeanalyse brukes til å beregne kavitasjonens område. Bildeanalyse gjøres ved hjelp av ImageJ.

Abstract

En eksperimentell og bildeanalyseteknikk presenteres for bildekavitasjonsbobler og beregning av deres område. Høyhastighets eksperimentell teknikk og bildeanalyseprotokoll presentert her kan også brukes til å bilde av mikroskopiske bobler i andre forskningsfelt; Derfor har den et bredt spekter av applikasjoner. Vi bruker dette på bildekavitasjon rundt tann ultralydskalere. Det er viktig å bildekavitasjon for å karakterisere det og forstå hvordan det kan utnyttes for ulike applikasjoner. Kavitasjon som forekommer rundt dental ultralyd scalers kan brukes som en ny metode for dental plakk fjerning, som ville være mer effektiv og forårsake mindre skade enn dagens periodontal terapi teknikker. Vi presenterer en metode for å forestille kavitasjonbobleskyene som oppstår rundt tann ultralydskalaertips ved hjelp av et høyhastighetskamera og et zoomobjektiv. Vi beregner også området kavitasjon ved hjelp av maskinlæring bildeanalyse. Åpen kildekode-programvare brukes til bildeanalyse. Bildeanalysen som presenteres er lett å replikere, krever ikke programmeringserfaring, og kan endres enkelt for å passe til brukerens anvendelse.

Introduction

Bilde av bevegelsen av bobler er viktig for ulike applikasjoner fordi den styrer hydrodynamikken til et system. Det er mange bruksområder hvor dette kan være nyttig: i fluidiserte sengereaktorer^1,,2,eller for rengjøring med kavitasjonsbobler^3,4. Formålet med bildebobler er å forstå mer om bobledynamikken eller om retningen og bevegelsen til en sky av bobler. Dette kan gjøres ved å observere strukturer avbildet og også ved å bruke bildeanalyse for å få kvantitativ informasjon, for eksempel størrelsen på boblene.

Kavitasjonsbobler er gass- eller dampenheter som forekommer i en væske når trykket faller under den mettede trykkverdien⁵. De kan oppstå når et akustisk felt påføres en væske ved ultralydfrekvenser. De vokser og kollapser gjentatte ganger, og ved kollaps kan frigjøre energi i form av høyhastighets mikrostråler og sjokkbølger^6,7. Disse kan løsne partikler på en overflate gjennom skjærkrefter og forårsake overflaterengjøring⁸. Kavitasjonsbobler undersøkes for overflaterengjøring i ulike bransjer, for eksempel for halvledere, mat og sårrengjøring^{9,,10,,11,,12}. De kan også brukes til å rengjøre tannplakk fra tenner og biomaterialer som tannimplantater^12,,13. Kavitasjon skjer rundt brukte tanninstrumenter som ultralydskalere og endodontiske filer og viser potensial som en ekstra rengjøringsprosess med disse instrumentene¹⁴.

Oscillasjonen av kavitasjonsbobler skjer over noen få mikrosekunder, og derfor kreves et høyhastighetskamera for å fange bevegelsen ved å bilde på tusenvis av rammer per^{sekund 8}. Vi demonstrerer en metode for avbildning mikroboble kavitasjon rundt dental ultralyd scalers. Målet er å forstå hvordan kavitasjon varierer rundt forskjellige ultralydskalaere, slik at den kan optimaliseres som en ny måte å rengjøre tannplakk på.

Tidligere metoder som brukes til å undersøke kavitasjonen inkluderer sonochemiluminesence, som bruker luminol for å oppdage hvor kavitasjon har skjedd^15,16. Dette er imidlertid en indirekte teknikk, og det er ikke i stand til å visualisere kavitasjonsboblene i sanntid. Derfor er det ikke i stand til å nøyaktig bestemme nøyaktig hvor det skjer på instrumentet, og ingen informasjon kan oppnås på bobledynamikken, med mindre det kombineres med andre bildeteknikker¹⁷. Høyhastighetsbilde kan bilde ikke bare kavitasjonsboblene som vokser og kollapser, men også typen kavitasjon som oppstår: kavitasjonskyer, mikrostreamere og mikrostråler^6,,7,,18. Disse gir mer informasjon om hvordan kavitasjonen kan rense overflater.

Vi presenterer en metode for avbildning kavitasjon mikrobobler ved hjelp av en høyhastighetskamera og beregning av gjennomsnittlig område av kavitasjon som oppstår. Denne metoden er demonstrert ved hjelp av et eksempel på kavitasjon som forekommer rundt forskjellige dental ultralyd scaler tips, selv om eksperimentelle og bildeanalysetrinn kan brukes til andre applikasjoner, for eksempel for avbildning av andre makroer og mikrobobler.

Protocol

1. Instrumentoppsett Velg instrumentet eller objektet som skal avbildes. I dette eksperimentet ble en ultralydskalaer avbildet. Kavitasjonsbobler oppstår rundt spissene av ultralydskalare i vann. Velg et mikroposisjoneringsstadium for at instrumentet skal avbildes med XYZ oversettelse og rotasjon. Plasser på en laboratoriekontakt. Fest instrumenthåndtaket til mikroposisjoneringsstadiet Velg en optisk gjennomsiktig vannbeholder for avbildning. Beholderen som brukes i disse eksperimentene ble opprettet med glassmikroskopsklier. Velg et XY-trinn med en rotasjonsplattform. Plasser på en laboratoriekontakt. Plasser vannbeholderen på scenen og fyll med filtrert vann (omvendt osmose eller destillert). 2. Oppsett av høyhastighetskamera Velg et høyhastighetskamera med ønsket bildefrekvens og oppløsning og en lyskilde med høy intensitet med en fiberlysfører. Fest en mikroposisjonering glideplate til høyhastighetskamerakroppen og koble den til et stativ. Velg et objektiv med ønsket oppløsning og brennvidde og fest dette til kameraet. For dette eksperimentet ble et zoomobjektiv brukt med en oppløsning på 8,4 μm /piksel. Fyll bildetanken med vann og plasser spissen på instrumentet som skal avbildes i vanntanken i ønsket retning. Etter å ha koblet kameraet og lastet live view i programvaren, bruk lav forstørrelse for å fokusere på spissen av ultralydsvekteren, flytting av lyskilden om nødvendig. Plasser apparatet og lyskilden foran kameraet og fokuser. Juster til ønsket bildefrekvens og lysstyrke.MERK: En høyere lysintensitet kreves for bildebehandling ved høye bildefrekvenser, korte lukkerhastigheter og/eller høye forstørrelser. Belysning kan gis i refleksjonsmodus eller overføringsmodus. I denne protokollen er belysningen gitt i overføringsmodus (lyst felt) ved hjelp av en høyintensitets kald belysningsenhet. Still inn en optimal bildefrekvens og lukkerhastighet for høyhastighetskameraet. I dette eksperimentet var bildefrekvensen 6400 fps med en lukkerhastighet på 262 nanosekunder. En kort lukkertid er nødvendig for bobler i rask bevegelse, for eksempel kavitasjonsbobler for å sikre at de er i fokus. Juster forstørrelsen av zoomobjektivet og intensiteten til lyskilden slik at bakgrunnen er hvit uten å bli overeksponert. 3. Kalibrering Registrer plasseringen av spissen (rotasjon i x-y stadium, rotasjonsvinkel av instrumentet for reproduserbarhet). Hvis du vil sikre at synsfeltet er konsekvent for hver gjentakelse, velger du et referansepunkt og noterer deg ned koordinatene. I dette tilfellet referansepunktet var spissen av ultralydskalaeren. Det kan deretter flyttes i fremtidige eksperimenter på samme sted innen visningsfeltet. Hvis pikselstørrelsen er ukjent, kan du bilde en gratigran med 10 μm markeringer på settet forstørrelse og bruke bildeanalyse programvare som Fiji for å beregne oppløsningen. 4. Høyhastighets videoopptak Bilde instrumentet uten kavitasjon. Dette vil bli trukket fra kavitasjonsbildene i bildeanalyse ved beregning av området av kavitasjonsboblene. Lagre videoene i et format som TIFF, slik at ingen bildekvalitet går tapt. Bilde instrumentet som fungerer med kavitasjon. Sørg for at det er tilstrekkelige rammer for nøyaktig analyse, for eksempel 5 repetisjoner med 500 bilder hver. 5. Bildebehandling Last ned Fiji19 fra ImageJ-nettstedet (https://imagej.net/Fiji). En ImageJ-makrokode er angitt som automatisk gjør bildeanalysetrinnene som er beskrevet nedenfor, og kan også endres for å passe programmet. De enkelte trinnene i makroen er beskrevet i trinn 5.3-5.5. Beskjær bildet for å fjerne mørkere områder som følge av ujevn belysning, om nødvendig. Kontroller at alle bildene beskjæres til samme størrelse og på det samme punktet i bildet. Konverter bildene til binære ved automatisk tersklering ved hjelp av en av de automatiske terskler. I dette eksemplet brukes minste automatiskerskel. Kjør kommandoen fyllhull for å fjerne eventuelle svarte piksler fra innsiden av boblene som ble segmentert feilaktig. Beregn histogrammet til stakken for å vise antall piksler som tilsvarer skaleringen og kavitasjonen i hver ramme. I dette tilfellet er pikslene som svarer til boblene hvite og har verdi 255. Lagre disse målingene. Gjenta trinn 5.3-5.6 for videoen av instrumentet som fungerer uten boblene. Beregn gjennomsnittsområdet av ultralydskalaerspissen bare fra resultatene av histogrammet. Trekk det gjennomsnittlige området av instrumentet fra hvert av områdene beregnet fra videoene av boblene rundt skaleren. Området av boblene er igjen å måle. Visualiser ved å trekke det binære bildet av skaleren fra det binære bildet av skaleren med bobler ved hjelp av bildekalkulatoren på Fiji. Beregn gjennomsnittet og standardavviket for bobleområdet. Konverter verdiene fra antall piksler til område (i dette tilfellet μm2) ved å multiplisere med pikselstørrelsen kvadrert. Beregn størrelsen på hver piksel ved å forestille seg en gratistikk med høyhastighetskameraet med samme forstørrelse som ble brukt til bildebehandling og bruk ImageJ til å angi skalaen. Plott inn dataene. Det er også mulig å gjennomføre statistisk analyse for å vise noen signifikant forskjell i bobleområdet hvis man sammenligner forskjellige forhold. 6. ImageJ makro Gå til Plugins > Ny > Makro i ImageJ/Fiji-menyen. Kontroller at IJ1 Macro er merket under språkmenyen og kopier og lim inn følgende kode. Klikk Kjør for å kjøre makroen (tilleggsfil).

Representative Results

Bildeanalysetrinnene kan ses i figur 1 for en av ultralydskalartipsene som er testet. En FSI 1000-spiss og en 10P-spiss ble avbildet inne i en vanntank med kjølevannet slått av (figur 2). Kavitasjon skjedde nær svingen av spissen FSI 1000 ved maksimal effekt, og nær den frie enden i spissen 10P (figur 3 og figur 4). Gjennomsnittlig kavitasjonsområde var 0,1 ± 0,07 mm2 for FSI 1000-spissen og 0,50 ± 0,25 mm2 for 10P-spissen (figur 5). Figur 1: Høyhastighets bildeoppsett og bildeanalysetrinn (a) Skjematisk for høyhastighetsbildeoppsettet som brukes i studien. (b) Skjematisk av bildeanalysetrinnene som brukes i studien, viser de rå bildene til venstre for skaleringsspissen og med kavitasjon, som deretter ble binarisert og trukket fra hverandre for å beregne området av kavitasjonskyene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Sammenligning mellom ulike tips Høyhastighets bilde stillbilder som viser kavitasjon som oppstår rundt de to ultralydskalaertipsene som er testet (a) FSI 1000 (b) 10P. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3: Tips 10P høyhastighetsbilder: Høyhastighets bilde stillbilder av tips 10P, fra en video tatt med 6400 bilder per sekund. Kavitasjon kan sees rundt den frie enden av spissen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Tips FSI1000 høyhastighetsbilder: Høyhastighets bilde stillbilder av tips FSI 1000, fra en video tatt med 6400 bilder per sekund. Kavitasjon kan sees rundt midten av spissen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Resultater fra kavitasjonsområdebildeanalyse. Gjennomsnittlig område av kavitasjon som forekommer rundt FSI 1000 og 10P ultralyd scaler tips beregnet ved hjelp av bildeanalyseteknikken som er beskrevet. Feilfeltene representerer standardavviket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tilleggsfil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Teknikken som er beskrevet i dette papiret, muliggjør avbildning av raske mikrobobler med høy romlig og timelig oppløsning. Det kan potensielt være til nytte for et bredt spekter av vitenskapelige disipliner som kjemiteknikk, tannbehandling og medisin. Tekniske applikasjoner inkluderer bildekavitasjonsbobler for rengjøring av overflater, eller for bildebobler i fluidiserte sengereaktorer. Biomedisinske applikasjoner inkluderer bildekavitasjon rundt medisinske og tanninstrumenter og imaging biofilm debridement fra hardt og mykt vev ved hjelp av kavitasjon bobler. I denne studien demonstrerte vi teknikken ved å avbilde kavitasjon rundt to forskjellige tann ultralydskalaertips. Mengden kavitasjon varierer mellom de to tipsene som ble testet i denne studien, med flere kavitasjonskyer observert rundt den frie enden av spissen 10P. Dette har tidligere vært knyttet til vibrasjonsalitud²⁰. Høyhastighetsvideoene viser at FSI 1000-spissen har mindre vibrasjon, noe som sannsynligvis vil være grunnen til at det er mindre kavitasjon rundt dette tipset.

En begrensning av bildeanalysemetoden er at bildeundertraksjonsteknikken for å fjerne området på skaleren ikke er helt nøyaktig fordi skaleren oscillerende og derfor kan subtraksjonen forlate noen områder av skaleren feilaktig segmentert som bobler. Dette er imidlertid gjort rede for ved å snitte området fra et stort antall rammer (n=2000). Dette ville ikke være et problem for programmer der objektet som skal trekkes fra, står stille. For studier der det bevegelige objektet som skal trekkes fra, har en mye høyere varians, anbefaler vi at du synkroniserer bevegelsene i begge videoene før du trekker fra for nøyaktige resultater. I den nåværende studien synkroniserte vi ikke svingningene, men siden vibrasjonen var lav, kan vi anta at svingningene tilsvarer hverandre i disse to målingene.

Bildeterskelseringen er nøyaktig fordi brightfield-belysningen gir en jevn bakgrunn med god kontrast. Det er viktig å sikre at bakgrunnen er ensartet og ikke inneholder andre objekter som kan segmenteres feilaktig. Terskelmetoden kan endres ved hjelp av andre automatiske terskler som passer til programmet. Manuell tersering, der brukeren angir terskelverdien, er også mulig, men anbefales ikke, da det reduserer reproduserbarheten til resultatene, siden ulike brukere velger forskjellige terskelverdier.

Bildeanalyse har blitt brukt til mange andre boblebildestudier. Disse bruker også en lignende metode for bakgrunnsbelysning for å få optimal kontrast mellom boblene og bakgrunnen, og tersklering for å segmentere^{boblene 21,,22,,23,,24}. Metoden som er vist i den nåværende studien kan også generaliseres til å brukes til mange forskjellige boblebildeapplikasjoner, som ikke er begrenset til bare høyhastighetsbildebehandling. Høyhastighets bildebehandling har blitt brukt til kavitasjon bobler generert i vann og også rundt instrumenter som endodontiske filer og ultralyd scalers^{12,25,26,27,28}. For eksempel rivas et al. og Macedo et al. brukte en høyhastighets kamera festet til et mikroskop, med belysning levert av en kald lyskilde til bilderengjøring med kavitasjon, og til bildekavitasjon rundt en endodontisk fil^17,29. Lys feltbelysning gir mer kontrast mellom bakgrunnen og boblene, noe som gjør det mulig å bruke enkle segmenteringsteknikker som tersklering, som demonstrert av Rivas et al. for avbildning og kvantifisering av kavitasjonerosjon og rengjøring over tid²⁹. Mørk feltbelysning gjør terskeling vanskeligere på grunn av den høyere variasjonen i^{gråskalaer 4,30}. Bildeanalyse har blitt brukt i andre studier for å samle mer informasjon om^{bobler 1,2}. Vyas et al. brukte en maskinlæringstilnærming for å segmentere kavitasjonsbobler rundt en ultralydsskalaer²⁰. Metoden som er beskrevet i det gjeldende papiret er raskere fordi den bruker enkel tersklering, slik at den er mindre beregningsintensiv, og bobler som forekommer over og under skaleren kan analyseres. Terskelmetoden som brukes i gjeldende papir, er imidlertid bare nøyaktig hvis bakgrunnen er ensartet. Hvis det ikke er mulig å få en jevn bakgrunn under bildebehandling, kan andre bildebehandlingsteknikker brukes som bruk av bakgrunnsundertraksjon ved hjelp av en rullende kuleradius for å korrigere for ujevn belysning, filtrering ved hjelp av median- eller gaussiske filtre for å fjerne støy, eller også bruke maskinlæringsbaserte^{teknikker 20,31}.

Til slutt presenterer vi en høyhastighets bilde- og analyseprotokoll for å bilde og beregne området til et mikroskopisk bevegelig objekt. Vi har demonstrert denne metoden ved å avbilde kavitasjonsbobler rundt en ultralydskalaer. Den kan brukes til bildekavitasjon rundt andre tanninstrumenter som endodontiske filer, og det kan enkelt tilpasses andre ikke-dental boble imaging applikasjoner.

Materials

0.25x attachment	Navitar	1-50011
12x with 12mm fine focus Long distance microscope zoom lens	Navitar	1-50486
2x adaptor with f mount	Navitar	1-62922
Cavitron Plus Ultrasonic Scaler	Dentsply Sirona	8184003
Cavitron Ultrasonic Insert FSI 1000FSI 1000	Dentsply Sirona	UCAFTHD
Fibre light guide. 8mm fibre bundle 1500mm length. Focussing lens assembly for Hayashi light, 1/4"-20 tripod thread for mounting.	Hayashi	LGC1- 8L1500
Geared head	Manfrotto	MN405	7.5kg load capacity
HDF7010 High-Power LED Endoscope light source. 150W LED provides cold output equivalent to 250W Xenon.	Hayashi	LA-HDF710
Heavy weight Tripod	Manfrotto	MN475B	Geared centre column, 12kg load capacity
High Speed Camera	Photron	103526	FASTCAM Mini AX200 900K M3 (16GB memory)
High-Precision Rotation Stage	Thorlabs	PR01/M
Laboratory jacks	Camlab	1194083
Micropositioning sliding plate	Manfrotto	SKU 454
Micropositioning stage 3D	Thorlabs	PT3/M
Micropositioning stage rotation	Thorlabs	OCT-XYR1/M	OCT-XYR1/M – XY Stage with Solid Top Plate
NEWTRON P5 XS Ultrasonic Scaler	Acteon	F62118
Ultrasonic Insert 10P	Acteon	F00253