यहां, हम होमोज़िगस उत्परिवर्ती लेमिन ए8-11 माउस मॉडल से प्रसव के बाद के शुरुआती विकासात्मक चरणों में एकल मांसपेशियों के तंतुओं को कुशलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करते हैं, जो एमरी-ड्रेफस मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (ईडीएमडी) के लिए एक बहुत ही गंभीर मॉडल है।
ऑटोसोमल प्रमुख एमरी-ड्रेफस मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (ईडीएमडी) एलएमएनए जीन में म्यूटेशन के कारण होता है, जो परमाणु लिफाफे और न्यूक्लियोप्लैम के घटकों को बनाए रखने वाले ए-टाइप न्यूक्लियर लैमिन्स, इंटरमीडिएट फिलामेंट प्रोटीन को एन्कोड करता है । हमने हाल ही में बताया है कि ईडीएमडी में मांसपेशियों को बर्बाद करने के लिए आंतरिक एपीजेनेटिक डिस्फंक्शन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो मांसपेशियों (उपग्रह) स्टेम कोशिकाओं को पुनर्योजी क्षमता को प्रभावित करते हैं। अलगाव और एकल myofibers की संस्कृति सबसे शारीरिक पूर्व वीवो दृष्टिकोण में से एक है अपने आला के भीतर उपग्रह कोशिकाओं के व्यवहार की निगरानी के लिए, के रूप में वे फाइबर और sarcolemma आसपास बेसल लैमिना के बीच रहते हैं । इसलिए, यह विभिन्न प्रकार के मुरीन मॉडलों से उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य प्रयोगात्मक प्रतिमान का प्रतिनिधित्व करता है। यहां, हम प्रसव के बाद की हिंडलिब मांसपेशियों(टिबिलिस एंटेर, एक्सटेंसर डिजोरम लंगस, गैस्ट्रोस्नेमियस और सोलियस)से अक्षुण्ण और व्यवहार्य एकल माइफबरर्स को अलग करने के लिए एक पुनः अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के बाद, हम जन्म के केवल 19 दिनों में Lamin 18-11-/-चूहों, एक गंभीर EDMD murine मॉडल से उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने में सक्षम थे ।
हम अलगाव प्रक्रिया का विस्तार करते हैं, साथ ही माइफिबर और उनके संबद्ध उपग्रह-कोशिकाओं-व्युत्पन्न संतान की एक अच्छी राशि प्राप्त करने के लिए संस्कृति की स्थिति का विस्तार करते हैं। जब विकास कारकों समृद्ध माध्यम में सुसंस्कृत, जंगली प्रकार चूहों से प्राप्त उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय, पैदा करना, और अंततः अंतर या आत्म नवीकरण से गुजरना । homozygous Lamin 18-11 में-/-उत्परिवर्ती चूहों इन क्षमताओं को गंभीर रूप से बिगड़ा हुआ है ।
यह तकनीक, यदि कड़ाई से पालन की जाती है, तो माइोफिबर से जुड़े उपग्रह कोशिका से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है, यहां तक कि प्रसव के बाद के विकास के चरणों में और नाजुक मांसपेशियों में भी।
कंकाल की मांसपेशी एक विभेदित ऊतक है जिसमें व्यायाम या आघात के बाद पुनर्जीवित करने की सबसे विस्तारित क्षमता में से एकहै 1। यह विशेषता मुख्य रूप से स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण होती है, जिसे बेसल लैमिना और मायोफिबर 2 के प्लाज्मलेम्मा के बीच उनकी परिधीय स्थिति के कारण उपग्रह कोशिकाएं कहाजाताहै। प्रसव के बाद के विकास के दौरान, उपग्रह कोशिकाएं पैदा होती हैं और उत्तरोत्तर अंतर करती हैं, इस प्रकार कंकाल मांसपेशियों के विकास में योगदान देती हैं। एक बार वयस्कता में, उपग्रह कोशिकाएं एक प्रतिवर्ती शांत अवस्था में प्रवेश करती हैं, और शारीरिक या रोग आघात पर, वे क्षतिग्रस्त मांसपेशियों की मरम्मत के लिए सक्रिय, प्रसार और अंतर करते हैं3। इन विभिन्न पुनर्योजी चरणों के माध्यम से ठीक से पारगमन करने और आत्म-नवीकरण से गुजरने के लिए उपग्रह कोशिकाओं की क्षमता में दोषों को मांसपेशियों को बर्बाद करने से दृढ़ता से जोड़ा गया है, या तो शारीरिक उम्र4,,5, 6,6 या मांसपेशियों में अपक्षयी रोगों, जैसे मस्कुलर डिस्ट्रोप7,,8,,9,,10।
उपग्रह कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए दो मुख्य संस्कृति दृष्टिकोण मौजूद हैं पूर्व वीवो: मोनोन्यूक्लिटेड कोशिकाओं से प्राथमिक मायोजेनिक संस्कृतियां, यांत्रिक रूप से और रासायनिक रूप से पूरी मांसपेशी11,,12से अलग होती हैं; या अलग – थलग पड़े मायोफबर की संस्कृति13,14,15, 16,17,17,18,19,,20. पहले मामले में, उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव की प्रक्रिया में माउस से निकाली गई पूरी मांसपेशियों का ट्रिट्यूशन, एक रासायनिक पाचन, निस्पंदन और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटाई (FACS)21शामिल है। यह प्रक्रिया, हालांकि विभिन्न प्रकार के मॉडलों से उपग्रह कोशिकाओं को अलग-थलग करने में प्रभावी है, कई चरों पर जोर देती है जो उपग्रह कोशिकाओं को तनाव में बेनकाब करती हैं और उनके शारीरिक आला22,,23को बाधित करती हैं। इसके विपरीत, माइओफाइबर अलगाव में मैट्रिक्स अपमानजनक एंजाइमों के साथ मांसपेशियों के ऊतकों का एक जेंटलर पाचन और एक यांत्रिक श्रेडिंग शामिल है जो स्टेम सेल20के लिए कम आघात का कारण बनता है। यह दूसरा दृष्टिकोण व्यवहार्य उपग्रह कोशिकाओं की अधिक कुशल पुनर्प्राप्ति की अनुमति देता है, जो बेसल लैमिना और सारकोलेम्मा के बीच अपने माइफइबर से शारीरिक रूप से जुड़ा रहता है, इस प्रकार उनके शारीरिक आला19,,20के भीतर विश्लेषण की अनुमति देता है।
पिछले वर्षों के दौरान कंकाल की मांसपेशियों से एकल माइफबर को ठीक से और कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए कई अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तावित किए गए हैं। पहले से ही 1 9 86 में बिस्चोफ ने फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस13 से फाइबर को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव किया और बाद में, 1 99 5 में, रोसेनब्लैट एट अल ने मायोफबर14का अधिक कुशल अलगाव प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित किया। तब से, कई अन्य लेखकों ने अन्य मांसपेशियों पर समायोजित प्रक्रियाओं का प्रस्ताव किया, जैसे कि एक्सटेंसर डिजकोरम लोंगस (ईडीएल) और टिबिलिस पूर्वकाल (टीए) 15,,16,,17,,18,,19,,20,जो लंबे समय तक होते हैं, भले ही अधिक नाजुक, मांसपेशियां14। अलग myofibers तो आसंजन में दोनों की खेती की जा सकती है, उपग्रह कोशिकाओं के विस्तार के लिए अनुमति देने के लिए-व्युत्पन्न myoblasts, या अस्थाई परिस्थितियों में, ९६ घंटे तक, एकल उपग्रह कोशिकाओं से प्राप्त संतान का पालन करने के लिए19 (चित्रा 1)। संस्कृति माध्यम के भीतर सीरम की परिवर्तनीय सांद्रता का उपयोग उपग्रह कोशिकाओं के सक्रियण, प्रसार और/या भेदभाव को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है, ताकि इन विभिन्न चरणों के माध्यम से ठीक से पारगमन करने की उनकी क्षमता का अध्ययन किया जा सके1।
हमने हाल ही में ईडीएमडी के माउस मॉडल में उपग्रह स्टेम सेल पूल की थकावट के पीछे एपिजेनेटिक तंत्र का वर्णन किया है, लैमिन 8-11-/-माउस7। चूंकि ये चूहे आमतौर पर24वर्ष की आयु के 4-8 सप्ताह के बीच मर जाते हैं, गंभीर मांसपेशियों की हानि के कारण, प्रसव के बाद की मांसपेशियों के विकास पर हमारे विश्लेषण को ध्यान केंद्रित करके रोग की शुरुआत में अंतर्निहित आणविक दोषों को पकड़ने का प्रयास किया गया था। फ्लोटिंग सिंगल माइफबर्स को जंगली प्रकार और लैमिन 8-11-/-उत्परिवर्ती 7 19 दिन पुराने चूहों से अलग और सुसंस्कृत किया गया था।7 इस स्तर पर, मांसपेशियों के दोष पहले से ही स्पष्ट हैं, लेकिन चूहे अभी भी व्यवहार्य हैं। हालांकि, चूंकि वयस्क चूहों की कंकाल मांसपेशियों के लिए एकल माइफबर्स निष्कर्षण के लिए उपरोक्त सभी उपर्युक्त प्रोटोकॉल अनुकूलित किए गए थे, इसलिए हमें उन्हें अपने उद्देश्यों के अनुकूल बनाने की आवश्यकता थी: उम्र और आकार की अवधि में बहुत छोटे चूहे, और बहुत नाजुक माइफबर। इस प्रकार, हम यहां रुडनिकी प्रयोगशाला19 द्वारा प्रस्तावित प्रोटोकॉल के हमारे पुनः अनुकूलन का वर्णन करते हैं ताकि प्रसव के बाद के विकास के दौरान चूहों से और गंभीर डिस्ट्रोफिक मांसपेशियों से एक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त की जा सके, जैसे कि लैमिन 8-11-/-चूहों 24से प्राप्त हुए । इस दृष्टिकोण का अंतिम लक्ष्य किसी भी अन्य माउस मॉडल में मायोफिबर से जुड़े मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया प्रदान करना है जब प्रसव के बाद के विकास के शुरुआती चरण रुचि के होते हैं, या माउस मॉडल के मामले में किसी विशिष्ट बीमारी को ले जाते हैं जो माइोफिबर्स को यांत्रिक तनाव के लिए अधिक संवेदनशील बनाता है।
बरकरार एकल myofibers के अलगाव मायोजेनेसिस के क्षेत्र में एक आवश्यक विधि है जब मुख्य उद्देश्य के लिए अपने आला के भीतर मांसपेशियों स्टेम कोशिकाओं की कोशिका स्वायत्त पुनर्योजी क्षमताओं की विशेषता है, स्वस्थ और रोग की स्थिति में । हालांकि, जब जैव रासायनिक या जीनोमिक अध्ययन रुचि के हैं, FACS-अलग उपग्रह कोशिकाओं सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है ।
एकल माइफबर अलगाव पूर्व-वीवो का पालन करने की अनुमति देता है, लेकिन सबसे शारीरिक तरीके से, मांसपेशियों के उत्थान के दौरान सभी चरणों एकल उपग्रह कोशिकाओं की गतिशीलता से गुजरना पड़ता है, जो हैं: सक्रियण, कोशिका विभाजन (असममित और सममित), भेदभाव और आत्म-नवीकरण द्वारा क्विसेंस पर लौटें। एक बार myofibers अस्थाई परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं, एकल उपग्रह कोशिकाओं को सक्रिय और कोशिकाओं के एक समूह के गठन का विस्तार, सभी एक ही उपग्रह सेल से प्राप्त । प्रसार, भेदभाव, सक्रियण या स्टेमनेस मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण तब कोशिका चरणों के बीच अनुपात को निर्धारित करने के लिए इष्टतम है।
हमारे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्य और बरकरार myofibers प्राप्त करने के लिए तेजी से लेकिन कोमल मांसपेशी विच्छेदन माना जा सकता है, कण्डरा से कण्डरा अलगाव द्वारा, किसी भी मांसपेशियों की क्षति से बचने के लिए । हमारी सलाह केवल तेज कैंची और छोटे तेज चिमटी का उपयोग करने के लिए और दस मिनट के लिए पूरी मांसपेशी विच्छेदन प्रक्रिया को सीमित करने के लिए है । जब बहुत छोटी मांसपेशियों (यानी, ईडीएल और टीए) को अलग करना मुश्किल होता है, तो उन्हें एक साथ काटना और बाद में फाइबर के बाद देशांतर योजना के साथ काटने वाली ठीक कैंची का उपयोग करके उन्हें विभाजित करना संभव है। यह रणनीति अंततः कम बरकरार myofibers दे देंगे, लेकिन व्यवहार्यता समझौता नहीं किया जाएगा । पाचन को सुविधाजनक बनाने के लिए गैस्ट्रोस्नेमियस जैसी बड़ी मांसपेशियों पर भी ऐसा ही किया जाना चाहिए। पाचन समय का अनुकूलन, जिसे अनुभवजन्य रूप से मान्य करने की आवश्यकता है, और अलग-अलग फाइबर का न्यूनतम हेरफेर भी बाद के विश्लेषण के सकारात्मक परिणाम के लिए दो महत्वपूर्ण पहलू हैं।
यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि इसे बहुत छोटे चूहों (उम्र और आयाम में) पर लागू किया जा सकता है, भले ही उनकी मांसपेशियां बेहद नाजुक हों। यहां तक कि यदि ऊपर उल्लेख नहीं किया गया है, तो तहखाने झिल्ली-लेपित व्यंजन18,,19का उपयोग करके लंबी अवधि के लिए संस्कृति व्यवहार्य मायोफिबर के लिए विच्छेदन के इस प्रोटोकॉल का पालन करना संभव है। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि यह स्थिति फ्लोटिंग स्थिति से पूरी तरह से अलग है, जहां आसंजन उत्तेजनाएं और निकटता उत्तेजनाएं अनुपस्थित हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम एंड्रिया बियांची, Laminopathies के इतालवी नेटवर्क और समर्थन और सभी रचनात्मक टिप्पणियों के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम कंफोकल माइक्रोस्कोप में बहुमूल्य मदद के लिए चियारा कॉर्डिग्लियरी के आभारी हैं। लेखक आंकड़ों के लिए तस्वीरें लेने में उनकी मदद के लिए डॉ बीट्राइस बिफेराली का शुक्रिया अदा करते हैं । यहां प्रस्तुत काम मेरा पहला AIRC अनुदान एन द्वारा समर्थित था । 18535, एएफएम-टेलीथॉन एन 21030, इटली के स्वास्थ्य मंत्री एन जीआर-2013-02355413 और कैरिप्लो 2017-0649 से सी.एल.सी.एम. को मेरा पहला एआईआरसी अनुदान एन 18993 और एएफएम-टेलीथॉन एन 22489 द्वारा समर्थित है।
4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
Lab equipment | Manufacturer | ||
Bunsen burner | |||
Confocal microscope | Leica | ||
Diamond pen | bio-optica | ||
Dissection pins | |||
FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
Glass coverslips | Thermofisher | ||
Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
Glass slides | Thermofisher | ||
Micro dissecting scissors | |||
Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
Micropipette tips | Corning | ||
Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
Rubber pipette bulbs | VWR | ||
Sharp tweezers | |||
Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
Water bath at 37°C | VWR |