Här föreslår vi en metod för att effektivt få enstaka muskelfibrer i tidiga postnatala utvecklingsstadier från homozygous mutant Lamin Δ8-11 mus modell, en mycket svår modell för Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD).
Autosomal dominerande Emery-Dreifuss muskeldystrofi (EDMD) orsakas av mutationer i LMNA genen, som kodar A-typ kärn-laminer, mellanliggande glödtråd proteiner som upprätthåller kärnhöljet och komponenterna i nukleoplasma. Vi rapporterade nyligen att muskelförtjning i EDMD kan hänföras till inneboende epigenetiska dysfunktioner som påverkar muskel (satellit) stamceller regenerativ kapacitet. Isolering och kultur av enda myofibers är en av de mest fysiologiska ex-vivo metoder för att övervaka satellitceller beteende inom sin nisch, eftersom de förblir mellan basala lamina kring fibern och sarcolemma. Därför är det ett ovärderligt experimentellt paradigm för att studera satellitceller från en mängd olika murine modeller. Här beskriver vi en omanpassad metod för att isolera intakta och livskraftiga enstaka myofibers från postnatala hindlimb muskler (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius och Soleus). Efter detta protokoll kunde vi studera satellitceller från Lamin Δ8-11 -/- möss, en allvarlig EDMD murine modell, på bara 19 dagar efter födseln.
Vi beskriver isoleringsförfarandet, liksom kulturförhållandena för att få en bra mängd myofibers och deras tillhörande satellit-celler-härledda avkomma. När odlas i tillväxt-faktorer rikt medium, satellitceller som härrör från vilda typ möss aktivera, föröka sig, och så småningom skilja eller genomgå självförnyelse. Hos homozygous Lamin Δ8-11 -/- mutantmöss är dessa förmågor allvarligt nedsatta.
Denna teknik, om strikt följs, gör det möjligt att studera alla processer kopplade till myofiber-associerade satellitcell även i tidiga postnatala utvecklingsstadier och i bräckliga muskler.
Skelettmuskeln är en differentierad vävnad med en av de mest utökade förmåga att regenerera efter träning eller trauma1. Denna egenskap beror främst på närvaron av stamceller, så kallade satellitceller på grund av deras perifera position mellan den basala lamina och plasmalemma av myofiber2. Under postnatal utveckling, satellitceller föröka sig och gradvis skilja, vilket bidrar till skelettmuskulaturen tillväxt. Väl i vuxen ålder, satellitceller in i en reversibel quiescent tillstånd, och på fysiologiska eller patologiska trauma, de aktiverar, föröka sig och differentiera för att reparera de skadade musklerna3. Defekter i kapaciteten hos satellitceller att korrekt transitering genom dessa olika regenerativa faser och att genomgå självförnyelse har varit starkt kopplade till muskelförtvining, antingen under fysiologiska åldrande4,,5,,6 eller i muskeldegenerativa sjukdomar, såsom muskeldystrofier7,8,9,10.
Det finns två huvudsakliga kulturmetoder för att studera satellitceller ex-vivo: primära myogena kulturer från monokärnor, mekaniskt och kemiskt separerade från hela muskeln11,12; eller kultur av isolerade myofibers13,,14,15,16,17,18,19,20. I det första fallet innebär processen för isolering av satellitceller trituration av hela muskler som extraherats från musen, en kemisk matsmältning, filtrering och fluorescerande aktiverad cellsortering (FACS)21. Detta förfarande, även om det är effektivt för att isolera satellitceller från en mängd olika modeller, innebär flera variabler som utsätter satellitceller för stress och stör deras fysiologiska nisch22,23. Däremot innebär myofiber isolering en mildare matsmältning av muskelvävnad med matris förnedrande enzymer och en mekanisk fragmentering som orsakar minskad trauma för stamceller20. Denna andra metod möjliggör en mycket effektivare hämtning av livskraftiga satellitceller, som förblir fysiskt knutna till sin myofiber mellan basala lamina och sarcolemma, vilket möjliggör analys inom deras fysiologiska nisch19,20.
Många olika protokoll har föreslagits under de senaste åren för att korrekt och effektivt isolera enstaka myofibers från skelettmuskulaturen. Redan 1986 föreslog Bischoff ett protokoll för att isolera fibrer från Flexor Digitorum Brevis13 och senare, 1995, ändrade Rosenblatt et al. protokollet för att få en effektivare separation av myofibers14. Sedan dess har många andra författare föreslagit justerade förfaranden på andra muskler, såsom Extensor Digitorum Longus (EDL) och Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, som är längre, även om mer bräckliga, muskler14. Isolerade myofibers kan sedan odlas både i vidhäftning, för att möjliggöra expansion av satellitceller-härledda myoblaster, eller under flytande förhållanden, upp till 96 timmar, att följa avkomman som härrör från enstaka satellitceller19 (figur 1). Variabla koncentrationer av serum inom odlingsmediet används för att utlösa aktivering, spridning och/eller differentiering av satellitceller, för att studera deras förmåga att korrekt passera genom dessa olika faser1.
Vi beskrev nyligen den epigenetiska mekanismen bakom utmattningen av satellitstamcellspoolen i musmodellen av EDMD, Lamin Δ8-11 -/- mus7. Eftersom dessa möss dör vanligtvis mellan 4-8 veckors ålder24, på grund av svår muskelförlust, gjordes ett försök att fånga de molekylära defekter som ligger bakom sjukdomens tidiga debut genom att fokusera vår analys på postnatal muskelutveckling. Flytande enda myofibers isolerades och odlade från vild typ och Lamin Δ8-11 -/- mutant7 19 dagar gamla möss. I detta skede är muskeldefekter redan uppenbara, men möss är fortfarande livskraftiga. Men eftersom alla ovan nämnda protokoll för enstaka myofibers utvinning var optimerade för skelettmuskulaturen hos vuxna möss, behövde vi anpassa dem till våra syften: mycket små möss i tid av ålder och storlek, och mycket bräckliga myofibers. Således beskriver vi här vår omanpassning av det protokoll som föreslagits av Rudnicki laboratoriet19 för att få ett betydande antal enda livskraftiga myofibers från möss under postnatal utveckling och från allvarliga dystrofa muskler, såsom de som härrör från Lamin Δ8-11 -/- möss24. Det slutliga målet med detta tillvägagångssätt är att tillhandahålla ett standardiserat förfarande för studier av myofibers-associerade muskel stamceller i någon annan mus modell när de tidiga stadierna av postnatala utveckling är av intresse, eller när det gäller mus modeller som bär någon specifik sjukdom som gör myofibers mer mottagliga för mekanisk stress.
Isolering av intakta enstaka myofibers är en viktig metod inom myogenesområdet när huvudsyftet är att karakterisera cellautonoma regenerativa kapacitet hos muskelstamceller inom sin nisch, under friska och patologiska tillstånd. Men när biokemiska eller genomiska studier är av intresse, FACS-isolerade satellitceller kan vara det bästa alternativet.
Single myofibers isolering gör det möjligt att följa ex-vivo, men på det mest fysiologiska sättet, dynamiken i alla steg enda satellitceller genomgår under muskelförnyelse, det vill säga: aktivering, celldelning (asymmetrisk och symmetrisk), differentiering och återgå till quiescence genom självförnyelse. När myofibers odlas under flytande förhållanden, de enda satellitceller aktivera och expandera bildar ett kluster av celler, alla härrör från samma satellitcell. Immunofluorescensanalys för spridning, differentiering, aktivering eller stamhet markörer är då optimalt att kvantifiera andelen mellan cellen stadier.
Det viktigaste steget i vårt protokoll för att få livskraftiga och intakta myofibers kan anses vara den snabba men milda muskel dissekering, genom sena-till-sena isolering, för att undvika muskelskador. Vårt råd är att endast använda vass sax och små vassa pincett och att begränsa hela muskeldissektionsproceduren till tio minuter. När det är svårt att isolera mycket små muskler (dvs. EDL och TA), är det möjligt att skära ihop dem och senare dela dem genom att använda fin sax skära längs den längsgående planen efter fibrerna. Denna strategi kommer så småningom att ge mindre intakta myofibers, men lönsamheten kommer inte att äventyras. Detsamma måste utföras på stora muskler som Gastrocnemius för att underlätta matsmältningen. Optimering av matsmältningstiden, som måste valideras empiriskt, och minimal manipulering av isolerade fibrer är också två avgörande aspekter för det positiva resultatet av efterföljande analys.
Fördelen med det protokoll som rapporteras här är att det kan tillämpas på mycket små möss (i ålder och dimension), även när deras muskler är extremt bräckliga. Även om inte nämns ovan, är det möjligt att följa detta protokoll av dissekering till då kultur livskraftiga myofibers under längre period med hjälp av källaren membran-belagda rätter18,19. Det är viktigt att tänka på att denna situation är helt annorlunda än flytande tillstånd, där vidhäftning stimuli och närhet stimuli är frånvarande.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Andrea Bianchi, det italienska nätverket av laminopathies och medlemmarna i laboratoriet för stödet och alla konstruktiva kommentarer. Vi är tacksamma mot Chiara Cordiglieri för den dyrbara hjälpen vid konfokalmikroskop. Författarna tackar Dr Beatrice Biferali för hennes hjälp med att ta bilder för siffror. Arbetet som presenteras här stöddes av My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, Italiens hälsominister n. GR-2013-02355413 och Cariplo 2017-0649 till C.L. C.M. stöds av My First AIRC grant n.18993 och AFM-Telethon n. 22489.
4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
Lab equipment | Manufacturer | ||
Bunsen burner | |||
Confocal microscope | Leica | ||
Diamond pen | bio-optica | ||
Dissection pins | |||
FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
Glass coverslips | Thermofisher | ||
Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
Glass slides | Thermofisher | ||
Micro dissecting scissors | |||
Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
Micropipette tips | Corning | ||
Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
Rubber pipette bulbs | VWR | ||
Sharp tweezers | |||
Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
Water bath at 37°C | VWR |