Gebruikmaken van troebelheid en trombo-lastografie voor complementaire clot karakterisering
Summary
Fibrin is verantwoordelijk voor stolselvorming tijdens hemostase en trombose. Troebelheidstesten en tromboelastograhy (TEG) kunnen worden gebruikt als synergetische instrumenten die complementaire beoordeling van een stolsel bieden. Deze twee technieken samen kunnen meer inzicht geven in hoe stollingscondities de vorming van fibrinstolsel beïnvloeden.
Abstract
Trombose is wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak. Fibrin(ogen) is het eiwit dat primair verantwoordelijk is voor stolselvorming of trombose. Daarom is het karakteriseren van fibrinestolselvorming gunstig voor de studie van trombose. Troebelheid en trombo-lastografie (TEG) worden beide op grote schaal gebruikt in vitro tests voor het monitoren van stolselvorming. Troebelheid meet dynamisch de lichtdoorlatendheid via een fibrinstolselstructuur via een spectrometer en wordt vaak gebruikt in onderzoekslaboratoria. TEG is een gespecialiseerde visco-elastische techniek die direct de sterkte van de bloedstolsel meet en voornamelijk wordt gebruikt in klinische omgevingen om de hemostase van patiënten te beoordelen. Met behulp van deze twee instrumenten beschrijft deze studie een methode voor het karakteriseren van een in vitro fibrin stolsel met behulp van een vereenvoudigd fibrinogen/trombinstoletmodel. Gegevenstrends in beide technieken werden onder verschillende stollingsomstandigheden vergeleken. Menselijke en runderfibrinstols werden in deze studie naast elkaar gevormd, omdat boviene stollingsfactoren vaak worden gebruikt als vervanging van menselijke stollingsfactoren in klinische en onderzoeksomgevingen. De resultaten tonen aan dat TEG en troebelheid stolselvorming volgen via twee verschillende methoden en wanneer ze samen worden gebruikt complementaire stollingssterkte en vezel structurele informatie bieden over diverse stollingsomstandigheden.
Introduction
Trombose is de pathologische vorming van een bloedstolsel in het lichaam dat de bloedcirculatie blokkeert, wat wereldwijd leidt tot hoge morbiditeit en mortaliteit. Er zijn 1 tot 2 gevallen van veneuze trombo-embolie en 2 tot 3 gevallen van trombose-geïnduceerde vasculaire ziekten per 1000 mensen per jaar1,2. Hier gepresenteerd is een methode gebruik te maken van trombo-lastografie (TEG) en troebelheid om stolselvorming te controleren onder verschillende stollingsomstandigheden. Fibrin(ogen) is het primaire eiwit dat verantwoordelijk is voor stolselvorming in het lichaam. In de laatste stappen van de stollingscasclaat worden fibrinopeptiden uit fibrinogen gespleten door trombine die de polymerisatie van onoplosbare fibrinemonmeren initieert terwijl het stolselzich ontwikkelt 3,4. Om stolselvorming in pathologische trombose te begrijpen, is het noodzakelijk om fibrinevorming te karakteriseren onder diverse stollingsomstandigheden. Meerdere stolsel monitoring testen zijn gebruikt om fibrin stolsel vorming in vitro studie. Prothrombin tijd (PT / INR) en geactiveerde gedeeltelijke tromboplastine tijd (aPTT) zijn twee veel voorkomende klinische tests die de integriteit van een specifieke stollingsroute te meten. Ze gebruiken echter tijd als de enige variabele die geen indicatie geeft van fysieke stolseleigenschappen5. Elektronenmicroscopie maakt visualisatie van de microstructuur van een volledig gevormd fibrinstolsel mogelijk, maar geeft geen informatie over het stolselvormingsproces zelf6. Onder alle testen, troebelheid testen en TEG bieden de mogelijkheid om stolsel kenmerken dynamisch te volgen in de tijd. Deze technieken maken het mogelijk om uitgebreide stollingsprofielen te meten en bieden daarom enig voordeel ten opzichte van andere fibrine stolselkarakteriseringstools.
Specifiek, troebelheid testen (of stolsel troebeleimetrie) wordt op grote schaal gebruikt voor onderzoek en klinische toepassingen als gevolg van de simplistische implementatie en de brede toegankelijkheid van spectrometers in onderzoekslaboratoria. Deze test maakt een dynamische meting van lichtdoorlatendheid door middel van een vormend stolsel mogelijk door individuele repetitieve metingen te doen op een gedefinieerde golflengte (meestal bij een golflengte in het bereik van 350 – 700 nm)7. Ook de temperatuur in de leeskamer kan worden aangepast. Naarmate fibringel zich vormt, wordt de hoeveelheid licht die door het eiwitnetwerk reist verminderd waardoor de absorptie na verloop van tijd toeneemt. Op dezelfde manier neemt de absorptie af wanneer het stolselnetwerk degradeert. Troebelheidstesten kunnen gemakkelijk worden gevoefd met behulp van een multi-well plaatformaat om een hoge doorvoermonsterscreening in zowel 96- als 384-putplaten mogelijk te maken. Verschillende stolsel kenmerken kunnen worden afgeleid van een troebelheid tracing curve (absorptie na tijd meting) die omvatten: maximale troebelheid, tijd tot maximale troebelheid, tijd om te stollen begin, en stolsel vorming tarief (Vmax). Een fibrin vezel massa / lengte verhouding kan ook worden afgeleid van ruwe troebelheid gegevens te schatten fibrin vezel dikte8,9,10.
TEG wordt voornamelijk gebruikt in de klinische setting om de hemostase en stolsellyse van patiënten te beoordelen. Het wordt ook vaak gebruikt in chirurgische toepassingen om te bepalen wanneer anti-fibrinolytische geneesmiddelen of hemostatische bloedproducten moeten worden toegediend11,12. Stolselvorming vindt plaats in een TEG-beker waarbij alle stollingscomponenten aan de beker worden toegevoegd voordat de test wordt ingeleid. De beker, met evoluerende stolsel, draait fysiek tegen een pin die in het midden wordt ingebracht en een elektromechanische torsiesensor meet de toenemende visco-elastische sterkte van het stolsel. Deze test wordt meestal uitgevoerd bij de fysiologische temperatuur van 37 °C; de temperatuur kan echter handmatig op het instrument worden aangepast. Maximale amplitude (MA), reactiesnelheid (R), kinetiektijd (K), α-hoek (Hoek) en time-to-maximum amplitude (TMA) worden door de TEG-software uit de dynamische TEG-tracering gehaald. Deze waarden worden meestal vergeleken met klinische normale bereiken om de stolling van een patiënt te beoordelen. Hoewel TEG niet precies een viscometer is, omdat het de stollingssterkte meet in millimetereenheden, biedt het wel belangrijke visco-elastische stolselgegevens en functioneert het als een waardevol klinisch beslissingsinstrument voor artsen om te beslissen om specifieke bloedproducten toe te dienen en therapeutische dosering aan te passen13. Wanneer zowel TEG- als troebelheidstesten samen worden gebruikt, bieden ze aanvullende informatie over de karakterisering van het stolsel, omdat stolselsterkte en kinetiek gemakkelijk kunnen worden geëxtraheerd uit TEG en fibrinvezeldikte toegankelijk is via optische troebelheidsmetingen.
Omdat fibrin een essentieel onderdeel is van een bloedstolsel, kan fibrinstololkkarakterisering onder diverse stolselvormingsomstandigheden waardevol inzicht geven in hoe een specifieke variabele bijdraagt aan het stolselvormingsproces en de uiteindelijke stolseleigenschappen. Inzicht in dit kan begeleiding bieden voor trombose diagnose en de ontwikkeling van therapieën. Om een representatievere fibrin stollende karakterisering te verkrijgen, kan plasma worden vervangen om de stolselvorming te controleren omdat het lijkt op in vivo stollingsomstandigheden dichter dan een vereenvoudigd fibrinogen/trombin modelsysteem. Echter, als gevolg van de ingewikkelde aard van de stolling cascade, stolsel vorming met behulp van plasma draagt bij aan de complexiteit, waardoor het moeilijker is om de impact van individuele factoren te isoleren. Het gebruik van een vereenvoudigd fibrinogen/trombin model voorkomt dat de hele stollingscascade moet worden gestart, waardoor de uiteindelijke fibrinevormingsstap kan worden geïsoleerd. Door het opnemen van twee grote fibrinevormende componenten (fibrinogen en trorombine), creëert deze setup een zeer gecontroleerde stolselvormingsconditie. Het is ook belangrijk op te merken dat, terwijl de vereenvoudigde stolsel model hier wordt gebruikt, dit protocol kan ook worden gebruikt om meer complexe stolsels te karakteriseren door het opnemen van extra stollingsfactoren. In deze studie worden fibrinstolololtaktisatie met troebelheid en TEG uitgevoerd door verschillende fibrinogen- en trombineconcentraties, ionische sterkte, pH en totale eiwitconcentratie in de stollingsoplossing om verschillende in vivo stollingsomstandigheden na te bootsen14. Details met betrekking tot deze wijzigingen in het protocol zijn opgenomen in sectie 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol toont het gebruik van twee verschillende stolsel karakterisering tools testen van een vereenvoudigde fibrinogen / trombin stolsel model met behulp van commercieel beschikbare componenten. Zowel TEG- als troebelheidstesten zijn eenvoudig uit te voeren. Ze bieden niet alleen eindpunt stolsel onderzoeken zoals max stolsel vorming (TurbMax en TEGMax) en stolsel vorming tijden (TurbTime en TEGTime),maar ook beoordelen de dynamische stolsel vorming proces. Dit maakt TEG …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural origins of fibrin clot rheology. Biophysical Journal. 77 (5), 2813-2826 (1999).
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. . Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. . The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
