Denne artikel beskriver, hvordan man udfører en kirurgisk metode til at hæmme dannelsen af sårepidermis under regenerering af axolotl-lemmer ved straks at suturere huden i fuld tykkelse over amputationsplanet. Denne metode gør det muligt for forskere at undersøge de funktionelle roller af såret epidermis i de tidlige stadier af lemmer regenerering.
Klassiske eksperimenter i salamander regenerativ biologi i løbet af det sidste århundrede har længe fastslået, at sårepidermis er en afgørende signalstruktur, der dannes hurtigt efter amputation og er nødvendig for regenerering af lemmer. Metoder til at studere dens præcise funktion på molekylært niveau i løbet af de sidste årtier har imidlertid været begrænset på grund af en mangel på præcise funktionelle teknikker og genomisk information, der er tilgængelig i salamandermodelsystemer. Spændende er det, at den seneste overflod af sekventeringsteknologier kombineret med frigivelsen af forskellige salamandergenomer og fremkomsten af funktionelle genetiske testmetoder, herunder CRISPR, gør det muligt at genbesøge disse grundlæggende eksperimenter i hidtil uset molekylær opløsning. Her beskriver jeg, hvordan man udfører den klassisk udviklede full skin flap (FSF) kirurgi i voksne axolotler for at hæmme dannelsen af sårepidermis umiddelbart efter amputation. Sårepidermis dannes normalt via distal migration af epitelceller i huden proksimal til amputationsplanet for at forsegle såret fra det ydre miljø. Operationen indebærer straks suturering af fuld tykkelse hud (som omfatter både epidermale og dermale lag) over amputationsplanet for at forhindre epitelcellemigration og kontakt med de underliggende beskadigede mesenkymale væv. Vellykkede operationer resulterer i hæmning af blastemadannelse og regenerering af lemmer. Ved at kombinere denne kirurgiske metode med nutidige nedstrøms molekylære og funktionelle analyser kan forskere begynde at afdække det molekylære grundlag for sårepidermis funktion og biologi under regenerering af lemmer.
Siden Lazzaro Spallanzani rapporterede det i 17681, har regenerering af salamanderlemmer været et af de mest velstuderede naturlige regenerative fænomener, der har fortryllet biologer i århundreder. Vellykket regenerering af lemmer afhænger af dannelsen, udvæksten og efterfølgende mønster af en udifferentieret cellulær struktur kendt som blastema. Forskere har gjort betydelige fremskridt med at forstå blastemaets cellulære sammensætning samt hvilke støttende væv og celletyper der er nødvendige for dets dannelse2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Alligevel forbliver de koordinerede signalmekanismer mellem forskellige væv og celletyper, der fører til initiering af blastemadannelse, dårligt forstået.
Et centralt krav til vellykket blastemadannelse og regenerering er sårepidermis, et forbigående og specialiseret epitel, der dækker amputationsplanet inden for 12 timer efter amputation10. Efter amputation migrerer epitelceller fra den intakte hud, der er proksimal til skaden, hurtigt over amputationsplanet for at danne et tyndt sårepitel14. Da blastema dannes i de følgende uger, udvikler den tidlige sårepidermis sig til en tykkere epitelsignalstruktur kaldet den apikale epitelhætte (AEC)15. Mens normal hud med fuld tykkelse indeholder både et epitel- og dermalt lag adskilt af en basal lamina, består sårepidermis / AEC kun af et epitellag og mangler en basal lamina16,17. Fraværet af basal lamina og dermis muliggør direkte kontakt mellem sårepitelcellerne og det underliggende væv, hvilket letter tovejssignalering mellem de to rum, der er kritisk for både blastemadannelse og vedligeholdelse17,18.
Klassiske eksperimentelle undersøgelser udtænkte forskellige innovative kirurgiske metoder til at undersøge sårepidermis / AEC-funktion og nødvendighed ved at hæmme dens dannelse. Disse metoder omfattede suturering19 eller podning af huden med fuld tykkelse20,21 over amputationsplanet, straks suturering af det amputerede lem i kropshulrummet22 og kontinuerlig daglig fjernelse eller bestråling af den tidlige sårepidermis og AEC23,24. Alt i alt fastslog disse eksperimenter ikke kun betydningen af sårepermermis/AEC, men bestemte også yderligere dets roller i tidlig vævssytolyse samt opretholdelse af stamcelleproliferation og blastemal udvækst13 gennem hele regenereringen.
Imidlertid var disse tidligere undersøgelser stort set begrænset til histologisk farvning såvel som tritierede thymidinimpulser for at spore celleproliferation. Faktisk er det først for nylig blevet gjort at revidere disse klassiske eksperimenter med moderne sekventeringsteknologier og funktionelle teknikker i salamandere, og det har ført til opdagelsen af yderligere roller for sårepermermis i modulering af inflammation og ECM-nedbrydning / aflejring i tidlige stadier af regenerering25. Med frigivelsen af forskellige salamandergenomer og transkriptomsekvenser26,27,28,29,30,31,32,33,34 samt det voksende antal funktionelle metoder, der er tilgængelige i salamanderarter11,35,36,37,38 , er forskere nu godt positioneret til at begynde at optrævle de molekylære mekanismer, der driver dannelse af sårepidermis, funktion og AEC-udvikling.
Desværre er flere af disse klassiske metoder, der anvendes til at hæmme dannelsen af sårepidermis, teknisk udfordrende og giver vanskeligheder for reproducerbarhed mellem biologiske replikater i det samme eksperiment. For eksempel kan vedligeholdelse af hudtransplantater være udfordrende, da transplantater i sidste ende kan falde af værtslemmet, og fjernelse af såret epidermis / AEC dagligt er vanskeligt uden at beskadige det underliggende væv. Desuden er suturering af det amputerede lem i kropshulrummet udfordrende og kræver også yderligere skade på indsættelsesstedet. På den anden side er suturering af fuld tykkelse hud umiddelbart over amputationsplanet relativt enkel, teknisk reproducerbar og introducerer minimal vævsskade. Denne kirurgiske metode med fuld hudklap (FSF) blev tidligere udviklet af Anthony Mescher i 1976 hos voksne newts (Notophthalmus viridiscens). Han demonstrerede, at FSF-operationen hæmmede dannelsen og funktionen af sårepidermis ved at forbyde både epitelcellemigration over amputationsplanet og direkte kontakt mellem epitelceller og det underliggende væv.
Her vises denne kirurgiske procedure trin for trin ved hjælp af axolotllemmet. Sammen med moderne molekylære og sekventeringsteknologier kan denne teknik vise sig at være meget nyttig for forskere til at uddybe vores forståelse af såretididermis / AEC-dannelse og funktion under regenerering af lemmer.
Denne artikel beskriver en protokol til udførelse af fuld hudklapoperationer i axolotl lemmer for at hæmme dannelsen af sårepidermis. Mens denne operation er relativt enkel og teknisk reproducerbar sammenlignet med andre metoder til at hæmme dannelsen af sårepidermis, er der flere kritiske trin, der kan påvirke operationens succes. For det første, når du trækker den intakte fulde hudklap over det udsatte underliggende væv, er det afgørende, at huden med fuld tykkelse ikke beskadiges på nogen måde. Skader på hudklappen kan stadig føre til dannelse af en lille sårepidermis, hvilket kan resultere i en lille blastema-lignende udvækst. For det andet skal du sikre, at suturer ikke falder ud under postoperativ pleje, da dette også kan føre til dannelse af en lille sårepidermis. Til dette punkt er det vigtigt at minimere den potentielle kontakt mellem det suturerede lem og eventuelle overflader, især i den første uge efter operationen. Flere måder at forhindre dette på indebærer at huse og anæstesi axolotl i en stor nok beholder, således at axolotl har masser af plads til at bevæge sig rundt efter operationen.
Denne operation har også flere begrænsninger. Måske er det mest bemærkelsesværdige, at succesen med operationer kun kan vurderes på to måder: Brug af dissekeringsomfanget i løbet af de første to uger af operationen til at søge efter fravær af en sårepidermis og / eller kontrollere, om der dannes et blastema inden for 3 uger. Mens disse metoder er effektive, er de relativt lave gennemstrømninger. Udviklingen af fremtidige transgene reporter axolotler til sår epidermis-specifikke markører kan hjælpe med hurtigere screening for vellykkede versus mislykkede operationer. Desuden er denne operation vanskeligere at udføre på yngre dyr, da den intakte hud er mere skrøbelig. Brug af sub-voksne eller voksne axolotler anbefales derfor.
Mens denne operation oprindeligt blev udviklet i N. viridiscens19, er den let tilpasset axolotls25,39 og kan sandsynligvis også anvendes på andre salamanderarter. Sammenfattende vil anvendelse af denne teknik til fremtidige lemmer regenerative undersøgelser give forskere mulighed for både at udvikle flere værktøjer til at tackle sår epidermis biologi og identificere de underliggende mekanismer, der driver dens funktion i initiering af blastema dannelse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren takker Doug for hans konstante opmuntring og urokkelige støtte samt medlemmerne af Melton-laboratoriet for deres nyttige feedback og kommentarer til manuskriptet. Forfatteren vil også gerne takke Harvard Office of Animal Resources (OAR) for deres dedikerede dyrepleje.
Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |