Vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole pour la vitrification minimale de volume des ovocytes immatures de chat avec des médias de laboratoire-faits sur des supports commerciaux. Il couvre chaque étape de l’isolement des ovocytes des gonades ex vivo à la vitrification et au réchauffement.
Abstract
Dans les programmes de conservation des animaux sauvages, la banque de mentières est cruciale pour protéger les ressources génétiques d’individus précieux et d’espèces rares et pour promouvoir la préservation de la biodiversité. Chez les félidés, la plupart des espèces sont menacées d’extinction, et les races domestiques sont utilisées comme modèle pour accroître l’efficacité des protocoles pour les services bancaires de germplasme. Parmi les techniques de cryoconservation des ovocytes, la vitrification est de plus en plus populaire dans la procréation assistée humaine et vétérinaire. La vitrification cryotop, qui a d’abord été développée pour les ovocytes humains et les embryons, s’est avérée bien adaptée aux ovocytes de chat. Cette méthode offre plusieurs avantages, tels que la faisabilité dans les conditions de terrain et la vitesse de la procédure, qui peut être utile lorsque plusieurs échantillons doivent être traités. Toutefois, l’efficacité dépend fortement des compétences de l’opérateur, et une normalisation intra- et inter-laboratoires est nécessaire, ainsi que de la formation du personnel. Ce protocole décrit la vitrification minimale du volume des ovocytes félins immatures sur un support commercial dans un protocole étape par étape respectueux du terrain, de la collecte des ovocytes au réchauffement. Conformément au protocole, la préservation de l’intégrité des ovocytes et la viabilité au réchauffement (jusqu’à 90 %) bien qu’il y ait encore place à l’amélioration des résultats de maturation après le réchauffement et de développement embryonnaire.
Introduction
La cryoconservation est devenue une étape clé des techniques de procréation assistée (ART). Chez l’homme, il permet la préservation de la fertilité ou le report de la parentalité pour des raisons médicales ou personnelles. Chez les animaux, il est nécessaire de surmonter la distance et le temps dans les accouplements planifiés, en particulier chez les animaux de ferme et les animaux de compagnie, ou de préserver le matériel génétique de sujets précieux dans les programmes de conservation, en particulier chez les espèces sauvages menacées. La cryoconservation des ormons est le meilleur choix lorsque les individus à élever n’ont pas encore été choisis ou afin d’éviter les problèmes éthiques associés à la congélation d’embryons, en particulier en médecine humaine1. Les spermatozoïdes sont relativement faciles à préserver et donnent des résultats satisfaisants après la décongélation, mais les ovocytes, en raison de leurs caractéristiques structurelles, pourraient être plus complexes à stocker. En effet, le faible rapport surface/volume, ainsi que la présence de la zona pellucida entourant l’ooplasma, limite le mouvement des cryoprotectants et de l’eau à travers la cellule2. En outre, chez les animaux domestiques, y compris les félidés, ils sont caractérisés par un cytoplasme riche en lipides, qui est pensé pour les rendre plus sensibles à la cryoconservation3.
La plupart des félidés sont menacés, et le chat domestique est utilisé comme un modèle pour développer des protocoles pour la préservation du germplasme grâce à la disponibilité des gonades de l’ovariectomie de routine. Chez les animaux sauvages, les gonades peuvent être obtenues après des chirurgies électives ou (plus fréquemment) post-mortem,et les gamètes immatures (vésicule germinale) peuvent être récupérés. La stimulation hormonale visant à obtenir des ovocytes matures (métaphase II) n’est pas aussi commune que dans les ARTs humains en raison des questions éthiques et de la réponse spécifique à l’espèce et à l’individu aux traitements4.
Par conséquent, le développement de stratégies de cryoconservation s’est concentré sur les gamètes immatures, qui peuvent généralement être récupérés après la mort inattendue ou soudaine d’individus rares. D’un point de vue biologique, il existe certaines différences dans la cryoconservation des gamètes immatures ou matures, chacun ayant ses avantages. Tout d’abord, l’ADN est plus protégé dans les ovocytes immatures, dont la vésicule germinale contient des chromosomes entourés d’une membrane nucléaire, tandis que le fuseau meiotique des ovocytes métaphasé II pourrait être plus vulnérable aux cryoin jurys5. Deuxièmement, les dommages causés par le cytosquelette induits par le froid pourraient affecter la rotation des fuseaux, l’extrusion du corps polaire, la migration pronucléaire et la cytokinesis, qui pourraient avoir des impacts différents selon la phase développementale des ovocytes, influençant la progression de la méiose ou les événements post-fertilisation. Enfin, et peut-être le plus important, alors que les ovocytes matures sont prêts à être fécondés, les gamètes immatures s’appuient sur le soutien des cellules cumulus environnantes pour passer par la maturation nucléaire et cytoplasmique6, et c’est la raison pour laquelle des complexes cumulus-ovocytes entiers (COC) sont cryopréservés. Cependant, la perte de cellules cumulus et/ou la perte de connexion fonctionnelle entre le ormiste et les cellules somatiques environnantes sont probablement l’effet le plus néfaste de la cryoconservation des COC immatures.
Parmi les techniques de cryoconservation, la vitrification est une que l’on peut appliquer plus facilement dans des conditions de terrain. Comparativement à la congélation lente (ou à taux contrôlé), la vitrification est plus rapide et ne nécessite pas d’équipement spécifique, comme un congélateur programmable. Afin de satisfaire les trois principes fondamentaux de la vitrification (c.-à-d. une viscosité élevée, liée à une forte concentration cryoprotecteur, de petits volumes et une diminution de température ultra-rapide), plusieurs milieux et supports ont été développés et utilisés spécialement chez les chats pour les ovocytes immatures et matures. En commençant par de simples pailles7, des dispositifs ont ensuite été développés pour atteindre l’objectif « volume minimum ». Cryoloop8, pailles à tiré ouvertes (OPS)9, gouttières en plastique (paille modifiée)10 et cryotubes11 ont été utilisés, jusqu’à ce qu’un dispositif plus efficace (c.-à-d. Cryotop) a été utilisé11, améliorant la survie et la reprise de la méiose. Cryotop (Figure supplémentaire 1) est un support disponible dans le commerce qui est devenu le système ouvert électif pour la vitrification. Développé pour la vitrification des ovocytes humains et des embryons, il se compose d’une petite bande de film attachée à un support en plastique dur, protégé par un bouchon de tube en plastique pendant le stockage12. Grâce à sa facilité d’utilisation et à la réduction extrême du volume de vitrification (aussi peu que 0,1 μL), ce qui conduit également à des taux de refroidissement et de réchauffement extrêmement rapides, ce soutien à la vitrification a été de plus en plus appliqué chez plusieurs espèces, y compris le chat domestique, dans lequel il a été utilisé avec une variété de médias13,14,15,16,17.
Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole de réchauffement de la vitrification-vitrification de collection, avec des modifications mineures de celui initialement développé pour les ovocytes humains, qui emploie des supports de laboratoire et commerciaux pour la vitrification minimale de volume et peut être facilement appliqué dans des conditions de champ pour la cryoconservation des COC félins immatures.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cryoconservation des ovocytes est une technique cruciale de conservation du germplasme, en particulier dans les taxons où de nombreuses espèces sont en voie de disparition, comme la famille des Felidae. Dans ce manuscrit, un protocole simple et respectueux du terrain pour la vitrification des ovocytes immatures de chat a été présenté. Les médias fabriqués en laboratoire, les soutiens à la vitrification minimale en volume et le personnel formé sont les facteurs clés du succès de cette méthode, qui permet d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été en partie soutenu par EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 et par Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Nous tenons également à remercier la Dre MariaGiorgia Morselli pour sa contribution aux expériences décrites par les présentes et à l’acquisition d’images.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
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