כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור אמצעי האחסון המינימלי של ויטריפיקציה של חתולים בלתי בוגרים עם מדיה מתוצרת מעבדה על תמיכות מסחריות. הוא מכסה כל צעד מ oocyte בידוד מ vivo גונדות לשעבר כדי ויטריפיקציה והתחממות.
Abstract
בתוכניות השימור של חיות הבר, הבנקאות המגיים חיונית לשמירה על משאבים גנטיים של אנשים יקרי ערך ומינים נדירים ולקדם שימור ביולוגי. ב-felids, רוב המינים מאוימים בפני הכחדה, וגזעים ביתיים משמשים כמודל כדי להגביר את היעילות של פרוטוקולים עבור בנקאות germplasm. בין טכניקות הקפאת הקריוציט, ויטריפיקציה הוא יותר ויותר פופולרי ב אדם וטרינרי בסיוע רבייה. קריוטופ ויטריפיקציה, אשר פותחה לראשונה עבור האדם oocytes ועוברים, הוכיחה להיות מתאים היטב עבור החתול oocytes. שיטה זו מציעה מספר יתרונות, כגון הכדאיות בתנאי שדה ומהירות ההליך, שיכולה להועיל כאשר יש צורך לעבד מספר דגימות. עם זאת, היעילות תלויה מאוד בכישורי המפעיל, ובקביעת הסדר הפנים-מעבדה, ובהתאם לצורך בהכשרה לאנשי צוות. פרוטוקול זה מתאר כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים בתמיכה מסחרית בפרוטוקול צעד אחר צעד ידידותי לשדה, מאוסף oocyte להתחממות. בעקבות הפרוטוקול, שימור שלמות oocyte ויכולת הכדאיות בהתחממות (גבוה ככל 90%) ניתן לצפות, למרות שעדיין יש מקום לשיפור התבגרות שלאחר ההתחממות ותוצאות פיתוח עובריים.
Introduction
הקפאה הקריוגנית הפכה לשלב מפתח של טכניקות שעתוק בסיוע (אומנויות). בבני אדם, היא מאפשרת שימור פוריות או דחייה של ההורות מסיבות רפואיות או אישיות. בבעלי חיים, יש צורך להתגבר על מרחק וזמן במקצועות מתוכננים, בעיקר בבעלי חיים חקלאיים ובחיות מחמד, או לשמר חומר גנטי של נושאים יקרי ערך בתוכניות שימור, במיוחד במינים פראיים בסכנת הכחדה. שמירת המשחק היא הבחירה הטובה ביותר כאשר אנשים להיות מתרבה לא נבחרו עדיין או על מנת למנוע בעיות אתיות הקשורות לקיפאון העובר, במיוחד ברפואה האנושית1. הזרע קל יחסית לשמר ולתת תוצאות משביע רצון לאחר הפשרה, אבל oocytes, בשל התכונות הקונסטרוקטיביות שלהם, יכול להיות מורכב יותר לאחסן. ואכן, היחס הנמוך של פני השטח/נפח, כמו גם הנוכחות של הסונה pellucida סביב האופלמה, מגביל את התנועה של הcryoprotectants והמים על פני התא2. יתר על כן, בעלי חיים ביתיים כולל felids, הם מאופיינים על ידי ציטופלסמה עשיר ליפיד, אשר נחשב להפוך אותם רגישים יותר לקריוגנית3.
רוב הפלאידים מאוימים, והחתול המקומי משמש כמודל לפיתוח פרוטוקולים לשימור גארפלמטר בזכות הזמינות של הגונדות מניתוח שגרתי. בחיות בר, הגונדות ניתן להשיג לאחר ניתוחים בחירה או (לעתים קרובות יותר) לאחר המוות, ולא בוגר (בתוספת vesicle לפוחית) מגיים ניתן לאחזר. גירוי הורמונלי שנועד לקבל בוגרת (מטאמשלב II) oocytes אינו נפוץ כמו באמנויות האדם בגלל הסוגיות המוסריות ואת התגובה הספציפית מיני לטיפולים4.
לכן, ההתפתחות של אסטרטגיות הקריואופרסטית התמקדה gametes בוגרים, אשר בדרך כלל ניתן לאחזר לאחר מוות בלתי צפוי או פתאומי של אנשים נדירים. מבחינה ביולוגית של השקפה, ישנם כמה הבדלים הקריוגנית של משחטים בוגרים או מבוגרים, כל אחד בעל יתרונותיה. ראשית, ה-DNA הוא מוגן יותר oocytes בוגר, אשר שלפוחית נבטי מכיל כרומוזומים מוקפת קרום גרעיני, בעוד הציר meiotic של השנייה oocytes יכול להיות פגיע יותר לקריופציעות5. שנית, נזק הנגרמת על ידי הצטננות השלד עשוי להשפיע על סיבוב ציר, הגוף שחול הקוטב, הגירה ברורה ו ציטוקינזה, אשר יכול להיות השפעות שונות על פי השלב ההתפתחותי oocyte, השפעה על התקדמות מיוזה או לאחר הפריה אירועים. בסופו של דבר, ואולי החשוב ביותר, בעוד oocytes בוגרת מוכנים להיות מופרית, בוגרים גמטות להסתמך על התמיכה של תאי קומולוס המקיפים לעבור התבגרות גרעינית cytoplasmic6, וזו הסיבה מדוע תלולית השלם מתחמי oocyte (cocs) הם cryopreserved. עם זאת, אובדן של תאים קומולוס ו/או אובדן של חיבור פונקציונלי בין תא רבייה והתאים הסומטיים שמסביב הם כנראה ההשפעה הפוגעת ביותר של הקריוגנית של cocs בלתי מפותחים.
בין טכניקות הקפאת שיריון, ויטריפיקציה הוא אחד כי ניתן להחיל בקלות רבה יותר בתנאי שדה. לעומת איטי (או שיעור מבוקר) קופא, ויטריפיקציה הוא מהיר יותר אינו דורש ציוד ספציפי, כגון מקפיא לתכנות. על מנת לספק את שלושת העקרונות הבסיסיים של ויטריפיקציה (כלומר, צמיגות גבוהה, מחובר לריכוז כימיות גבוה, כרכים קטנים וירידה בטמפרטורה מהירה), מספר מדיה ותמיכה במיוחד פותחו ובשימוש אצל חתולים עבור האוזציטים הן בוגרות והן בוגרת. החל עם קשיות פשוטה7, התקנים פותחו אז כדי להגיע “נפח מינימלי” המטרה. קריולופ8, פתח משכו קשיות (OPS)9, מרזבים פלסטיק (שונה קש)10 ו קריוצינוריות11 כבר בשימוש, עד מכשיר יעיל יותר (כלומר, קריוטופ) היה מועסק11, שיפור הישרדות ו היוסיס חידוש. קריוטופ (משלים איור 1) היא תמיכה מסחרית הפכה להיות מערכת פתוחה בחירה עבור ויטריפיקציה. פותח עבור הויטריפיקציה של האדם האוציטים ועוברים, הוא מורכב רצועת סרט קטן המצורפת בעל פלסטיק קשיח, מוגן על ידי כובע צינור פלסטיק במהלך אחסון12. בזכות השימושיות שלה ועל הפחתת הקיצונית ויטריפיקציה volume (מעט כמו 0.1 μl), אשר גם מוביל לשיעורי קירור מהירה ביותר ומחמם, זו תמיכה ויטריפיקציה הוחל יותר ויותר במינים מספר, כולל החתול המקומי, שבו הוא שימש עם מגוון רחב של מדיה13,14,15,16,17.
מטרת כתב היד הזה היא לתאר את הפרוטוקול אוסף-ויטריפיקציה-התחממות, עם שינויים קלים מן האחד שפותחה במקור עבור הנגיף האנושי, אשר מעסיקה מעבדות מתוצרת מסחרית ותמיכה מסחריים עבור אמצעי אחסון מינימלי ויטריפיקציה והוא יכול להיות בקלות להחיל בתנאי שדה עבור קריוגנית של חתולים בלתי מפותחים COCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקפאה הקריוגנית היא טכניקת שימור מכרעת, במיוחד בתחום המינים בהם מינים רבים בסכנת הכחדה, כגון משפחת פליקס. בכתב יד זה, פרוטוקול פשוט וידידותי לשדה לויטריפיקציה של החתול הילדותי אוציטים הוצג. מדיה מתוצרת מעבדה, אמצעי אחסון מינימלי ויטריפיקציה תומך ועובדים מיומנים הם גורמי מפתח להצלחת שיטה ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת באופן חלקי על ידי EVSSAR (האגודה האירופית וטרינרית עבור רבייה בעלי חיים קטנים) גרנט 2016 ועל ידי אוניברסיטת הווסטאה degli Studi די מילאנו, פסנתר די Sostegno אלה Ricerca 2019 (לינאה 2 Azione A). כמו כן, אנו רוצים להודות לד ר מרידעגיה מורסלי על תרומתו לניסויים המתוארים בזאת ולרכישת תמונה.
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
References
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).
- Luvoni, G. C. Gamete cryopreservation in the domestic cat. Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).
- Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids. Theriogenology. 109, 14-21 (2018).
- Parks, J. E. Hypothermia and mammalian gametes. Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).
- Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Biologie du développement. 226 (2), 167-179 (2000).
- Murakami, M., et al. Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose. Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).
- Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen. Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes. Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).
- Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).
- Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes. Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).
- Kuwayama, M. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method. Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).
- Pope, C. E., et al. In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer. Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).
- Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes. Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).
- Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique. Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions. Animals. 9 (6), 329 (2019).
- Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes. Reproduction in Domestic Animals. , (2020).
- Wood, T. C., Wildt, D. E. Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).
- Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method. Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).
- Mullen, S. F., Critser, J. K. The science of cryobiology. Oncofertility – Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of cryopreservation by vitrification. Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).
- Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification. Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).
- Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).
- Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives. Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).
- Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes. Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).
- Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season. International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).
- Nowak, A., et al. The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method. Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).
