अपरिपक्व फेलिन ओसाइट्स का न्यूनतम वॉल्यूम विट्रीफिकेशन
Summary
यह पांडुलिपि वाणिज्यिक समर्थन पर प्रयोगशाला निर्मित मीडिया के साथ अपरिपक्व बिल्ली ओसाइट्स के न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। यह पूर्व वीवो गोनाड से vitrification और वार्मिंग के लिए oocyte अलगाव से हर कदम को शामिल किया गया ।
Abstract
जंगली जानवरों के संरक्षण कार्यक्रमों में, गेमे बैंकिंग मूल्यवान व्यक्तियों और दुर्लभ प्रजातियों के आनुवंशिक संसाधनों की रक्षा और जैव विविधता संरक्षण को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण है । फेलिड्स में, अधिकांश प्रजातियों को विलुप्त होने की धमकी दी जाती है, और घरेलू नस्लों का उपयोग जर्मप्लाज्म बैंकिंग के लिए प्रोटोकॉल की दक्षता बढ़ाने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है। ओसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन तकनीकों में, विट्रीफिकेशन मानव और पशु चिकित्सा सहायता प्राप्त प्रजनन में अधिक से अधिक लोकप्रिय है। क्रायोटॉप विट्रीफिकेशन, जो पहले मानव ओसाइट्स और भ्रूण के लिए विकसित किया गया था, ने बिल्ली ओसाइट्स के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होने का प्रदर्शन किया है। यह विधि कई फायदे प्रदान करती है, जैसे कि क्षेत्र की स्थिति में व्यवहार्यता और प्रक्रिया की गति, जो कई नमूनों को संसाधित करने की आवश्यकता होने पर सहायक हो सकती है। हालांकि, दक्षता दृढ़ता से ऑपरेटर के कौशल पर निर्भर है, और अंतर और अंतर प्रयोगशाला मानकीकरण की जरूरत है, साथ ही कार्मिक प्रशिक्षण । यह प्रोटोकॉल ओसाइट संग्रह से वार्मिंग तक, कदम क्षेत्र के अनुकूल प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम में एक वाणिज्यिक समर्थन पर अपरिपक्व बिल्ली के समान ओसाइट्स के न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल के बाद, वार्मिंग में ओसाइट अखंडता और व्यवहार्यता का संरक्षण (90% जितना अधिक) उम्मीद की जा सकती है, हालांकि अभी भी वार्मिंग के बाद परिपक्वता और भ्रूणीय विकास परिणामों में सुधार की गुंजाइश है।
Introduction
क्रायोप्रिजर्वेशन असिस्टेड प्रजनन तकनीकों (एआरटी) का एक महत्वपूर्ण कदम बन गया है। मनुष्यों में, यह चिकित्सा या व्यक्तिगत कारणों के लिए प्रजनन क्षमता या पितृत्व के स्थगन के संरक्षण की अनुमति देता है । जानवरों में, विशेष रूप से खेत जानवरों और पालतू जानवरों में, या विशेष रूप से जंगली लुप्तप्राय प्रजातियों में, नियोजित संभोग में दूरी और समय को दूर करना आवश्यक है। जब पैदा होने वाले व्यक्तियों को अभी तक नहीं चुना गया है या भ्रूण ठंड से जुड़े नैतिक मुद्दों से बचने के लिए, विशेष रूप से मानव चिकित्सा1में, गेमटे क्रायोप्रिजर्वेशन सबसे अच्छा विकल्प है। शुक्राणुओं को संरक्षित करना और विगलन के बाद संतोषजनक परिणाम देना अपेक्षाकृत आसान है, लेकिन उनकी संरचनात्मक विशेषताओं के कारण ओसाइट्स, स्टोर करने के लिए अधिक जटिल हो सकते हैं। दरअसल, कम सतह/मात्रा अनुपात, साथ ही ऊप्लाज्मा के आसपास जोना पेलुसिडा की उपस्थिति, कोशिका2में क्रायोप्रोटेक्टेंट और पानी के आंदोलन को सीमित करती है । इसके अलावा, फेलिड सहित घरेलू जानवरों में, उन्हें लिपिड-समृद्ध साइटोप्लाज्म की विशेषता है, जिसे उन्हें क्रायोप्रिजर्वेशन 3 के प्रति अधिक संवेदनशील बनाने के लिए सोचाजाताहै।
अधिकांश फेलिड्स को धमकी दी जाती है, और घरेलू बिल्ली का उपयोग नियमित ओवेरेक्टॉमी से गोनाड की उपलब्धता के लिए जर्मप्लाज्म संरक्षण के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है। जंगली जानवरों में, गोनाड को वैकल्पिक सर्जरी या (अधिक बार) पोस्टमार्टमके बाद प्राप्त किया जा सकता है, और अपरिपक्व (अंकुरित वेसिकल) गेमेस को वापस लाया जा सकता है। हार्मोनल उत्तेजना परिपक्व (मेटाफेज द्वितीय) oocytes प्राप्त करने के उद्देश्य से मानव ARTs में के रूप में के रूप में आम नहीं है क्योंकि नैतिक मुद्दों और प्रजातियों के-और उपचार के लिए व्यक्तिगत विशिष्ट प्रतिक्रिया4।
इसलिए, क्रायोप्रिजर्वेशन रणनीतियों के विकास ने अपरिपक्व गेम्स पर ध्यान केंद्रित किया है, जिसे आमतौर पर दुर्लभ व्यक्तियों की अप्रत्याशित या अचानक मृत्यु के बाद वापस लाया जा सकता है। जैविक दृष्टिकोण से, अपरिपक्व या परिपक्व गेम के क्रायोप्रिजर्वेशन में कुछ अंतर हैं, प्रत्येक के फायदे हैं। सबसे पहले, डीएनए अपरिपक्व ओसाइट्स में अधिक संरक्षित है, जिसके अंकुरित वेसिकल में परमाणु झिल्ली से घिरे गुणसूत्र होते हैं, जबकि मेटाफेज II ओसाइट्स का मेयोटिक धुरी क्रायोनिंज5के लिए अधिक असुरक्षित हो सकता है। दूसरे, ठंड से प्रेरित साइटोस्केलेटन नुकसान धुरी रोटेशन, ध्रुवीय शरीर के निष्कासन, प्रोन्यूक्लियर माइग्रेशन और साइटोकिन्सिस को प्रभावित कर सकता है, जिसका ओसाइट विकास चरण के अनुसार अलग-अलग प्रभाव हो सकते हैं, जो मेयोसिस प्रगति या निषेचन के बाद की घटनाओं को प्रभावित करते हैं। अंत में, और शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, जबकि परिपक्व ओसाइट्स निषेचित होने के लिए तैयार हैं, अपरिपक्व गेम परमाणु और साइटोप्लाज्मिक परिपक्वता6के माध्यम से जाने के लिए आसपास के क्यूमुलस कोशिकाओं के समर्थन पर भरोसा करते हैं, और यही कारण है कि पूरे क्यूमुलस-ओसाइट कॉम्प्लेक्स (सीओसी) क्रायोप्रीयरेयव हैं। हालांकि, क्यूमुलस कोशिकाओं का नुकसान और/या गेम्टे और आसपास के दैहिक कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक संबंध का नुकसान शायद अपरिपक्व COCs के क्रायोप्रिजर्वेशन का सबसे हानिकारक प्रभाव है ।
क्रायोप्रिजर्वेशन तकनीकों में, विट्रीफिकेशन एक है जिसे क्षेत्र की स्थितियों में अधिक आसानी से लागू किया जा सकता है। धीमी गति से (या नियंत्रित दर) ठंड की तुलना में, विट्रीफिकेशन तेज है और इसके लिए विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, जैसे कि प्रोग्रामेबल फ्रीजर। विट्रीफिकेशन के तीन मौलिक सिद्धांतों (यानी उच्च चिपचिपाहट, उच्च क्रायोप्रोटेक्टिव एकाग्रता, छोटी मात्रा और अल्ट्रा-रैपिड तापमान में कमी से जुड़े) को संतुष्ट करने के लिए, कई मीडिया और समर्थन विशेष रूप से विकसित किए गए हैं और बिल्लियों में अपरिपक्व और परिपक्व ओसाइट्स दोनों के लिए उपयोग किए जाते हैं। सरल तिनके7के साथ शुरुआत, उपकरणों तो “न्यूनतम मात्रा” लक्ष्य तक पहुंचने के लिए विकसित किया गया । क्रायोलोप8,ओपन खींचा तिनके (ऑप्स)9,प्लास्टिक गटर (संशोधित स्ट्रॉ)10 और क्रायोट्यूब11 का उपयोग किया गया है, जब तक कि एक अधिक कुशल डिवाइस (यानी, क्रायोटॉप)11 नियोजितनहीं किया गया था, अस्तित्व और मेयोसिस बहाली में सुधार। क्रायोटॉप(पूरक चित्रा 1)एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समर्थन है जो विट्रीफिकेशन के लिए वैकल्पिक खुली प्रणाली बन गया है। मानव ओसाइट्स और भ्रूण के विट्रीफिकेशन के लिए विकसित, इसमें एक छोटी सी फिल्म पट्टी होती है जो एक कठोर प्लास्टिक धारक से जुड़ी होती है, जो भंडारण12के दौरान प्लास्टिक ट्यूब कैप द्वारा संरक्षित होती है। इसकी उपयोगिता और विट्रीफिकेशन वॉल्यूम (0.1 माइक्रोन) में अत्यधिक कमी के लिए धन्यवाद, जो बेहद तेजी से ठंडा और वार्मिंग दरों की ओर भी जाता है, यह विट्रीफिकेशन समर्थन घरेलू बिल्ली सहित कई प्रजातियों में तेजी से लागू किया गया है, जिसमें इसका उपयोग विभिन्न प्रकार,के मीडिया13,14, 15,,15,16,17के साथ किया गया है।,
इस पांडुलिपि का उद्देश्य एक संग्रह-विट्रीफिकेशन-वार्मिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करना है, जिसमें मूल रूप से मानव ओसाइट्स के लिए विकसित एक से मामूली संशोधन किए गए हैं, जो न्यूनतम मात्रा विट्रीफिकेशन के लिए प्रयोगशाला-निर्मित मीडिया और वाणिज्यिक समर्थन को नियोजित करते हैं और इमामाचर फेलिन्स के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए क्षेत्र की स्थितियों में आसानी से लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन एक महत्वपूर्ण जर्मप्लाज्म संरक्षण तकनीक है, विशेष रूप से टैक्सा में जहां कई प्रजातियां खतरे में हैं, जैसे फेलिडी परिवार। इस पांडुलिपि में अपरिपक्व बिल्ली ओसाइट्स के विट्रीफ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आंशिक रूप से ईव्ससार (यूरोपियन वेटनरी सोसाइटी फॉर स्मॉल एनिमल रिप्रोडक्शन) ग्रांट 2016 और यूनीवर्सिटा डेगली स्टडी डि मिलानो, पियानो डी सोस्टेग्नो अल्ला राइसर्का 2019 (लिना 2 अजिओन ए) द्वारा समर्थित किया गया था। हम डॉ मारियाजिर्जिया मोर्सेली को इसके द्वारा चित्रित और छवि अधिग्रहण के प्रयोगों में उनके योगदान के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं ।
Materials
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | / |
| Automatic pipettes & tips | / | / | Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 µL |
| Surgical scalpels | / | / | Size 10 is usually ok |
| Bunsen beak | / | / | / |
| Clamps | / | / | Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen |
| Cryotop | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.CR | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | / |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | E9129 | / |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | / |
| Glass Pasteur pipettes | / | / | Advised lenght 230 mm (100+130) |
| Gobelets | / | / | According to the canisters of the storage tank |
| Heating stage | / | / | All heating stages are ok, as long as they can keep 38ºC |
| Liquid nitrogen | / | / | / |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | / |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | / |
| Penicillin G sodium | Sigma-Aldrich | P3032 | / |
| Polyvinyl alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136 | / |
| Repro plate | Kitazato (distributor: MBT – Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | Distributors and catalog number may change in different countries |
| Stereomicroscope | / | / | As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok |
| Storage tank | / | / | Any regularly filled tank is ok |
| Streptomycin sulphate | Sigma-Aldrich | S9137 | / |
| Styrofoam/nitrogen resistant box | / | / | All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called "Cooling Rack" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| Timers | / | / | All timers which can be set on times until 9 minutes are ok |
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